植物络合素在小麦响应砷胁迫过程中的作用及其测定方法(3)
时间:2018-07-05 20:04 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
并取样。⼩麦根系⽤⾃来⽔反复冲洗⼲净,置于预冷的10 mmol/L CaCl2溶液中静置 10 min,以去除根表⾯吸附的砷，然后⽤去离⼦⽔冲洗⼲净,最后⽤吸⽔纸将其表⾯⽔分吸 ⼲。将新鲜样品⽤液氮(196 °C)迅速冷冻,再置于-80°C 冰箱中储存。 1.3 ⼩⻨⻓期溶液培养 ⼩麦萌发和处理⽅法同上。在1/4 Hoagland营养液中培养⼀周后将⼩麦幼苗转⼊8升1/ 4 Hoagland营养液中继续培养，⼀个⽉后将Hoagland营养液浓度由1/4增⾄1/2。处理过 程中每 更换营养液，分别于苗期、分蘖期和拔节期收苗待测。1.4 植物组织中 PCs 的提取及其柱前衍⽣化反应 参照 Sneller 等[6] 的⽅法,提取植物组织中的⾮蛋⽩巯基化合物。称取 0 5 g植物鲜样放 ⼊研钵中,加液氮并研磨⾄粉末状,加2 mL 0.1%TFA(含6.3 mmol/L DTPA,pH 10) 充分混 匀,冰浴超声 30 min 后于 12000 r/min、4°C 下离⼼ 10 min,收集上清液。为避免巯基化 合物接触空⽓⽽氧化损失,⽴即进⾏柱前衍⽣化反应,即向 250μL 5 种巯基化合物标准液 或植物组织上清液中加⼊450 μL 200 mmol / L HEPPS( 含 6 3 mmol/L MDTPA, pH 8.2) 和 10 μL 25 mmol/L mBBr 充分混合,于 50°C 下反应 30 min, 然后加⼊ 300 μL 1 mmol/L MSA 终⽌反应,摇匀, 过0.45 μm 滤膜后,转移⾄棕⾊瓶内, 4°C 下保存⾄ UPLC 分析测 定。 同时作试剂空⽩衍⽣化反应,确定试剂空⽩杂质峰。 1.5 样品提取条件优化 1.5.1 样品称取量分别设置为：0.3g、0.5 g 和1.0g。 1.5.2加⼊的TCEP浓度设置为：0、5、25 和 50 mmolL-1。 1.5.3加⼊的mBBr浓度为25 mmolL-1和50 mmolL-1。 1.5.4将HEPPS试剂pH值设定为8.5和9.5. 1.6 加标回收试验 在衍⽣化完成后的样品待测液中加⼊衍⽣化后的标准液（1.25μg/ml），并设置对 照，注意加⼊标准液后要保持总体积保持不变。 1.7试验结果的收集和处理 1.7.1 收集⽐对UPLC测量后样品的图谱，对⽐不同实验条件下出峰时间以及峰型的完 整程度等。 1.7.2 计算加标回收试验的回收率，计算⽅法： 2 结果与分析 2.1 标准曲线的制作 五种巯基化合物（Cys、GSH（PC1）、PC2、PC3、PC4）经UPLC分离后的图谱见图 由图1 可见较为清晰的优尔个峰，分别对应Cys、GSH、mbbr、PC2、PC3和PC4，其出 峰时间分别为1.4min、2.5min、4.2min、7.3min、10.2min 、12.4min。 根据UPLC测定结果的峰⾯积与对应-SH化合物的浓度制作Cys、GSH、PC2、PC3和 PC4的标准曲线（图2）。随着加⼊标准物质的浓度增加，峰⾯积明显增⼤，峰⾯积和 五种巯基化合物浓度间可见明显的线性关系。 图3显⽰，三种取样量的提取液经UPLC检测均能出现明显的峰图，并能看到峰⾯积 随取样量的增加明显增⼤（图3）。但是，样品提取质量为0.5g和1.0g时与0.3g相⽐杂峰 增多，这在⼀定程度上⼲扰了试验结果的测定和统计，所以提取质量为0.3g时可以得到 最清晰的分离结果，明显可见Cys、GSH、PC2、PC3和PC4的峰按顺序出现，⼲扰杂峰 较少。峰⾯积与取样量的关系见图4。随着取样量的增加，Cys、GSH和PC2峰⾯积明显 增加，峰⾯积与取样量呈线性相关，PC3和PC4的峰⾯积与取样量未见明显线性相关。 2.2.2 TCEP浓度各-SH化合物分离结果的影响由图5可见，TCEP加⼊浓度为0、10、25和50 mmol /L时经UPLC分离后基本均能出 现明显的Cys、GSH、PC2、PC3和PC4的峰，当TCEP浓度为0和50mmol/L时，UPLC测 定明显杂峰增多，⼀定程度⼲扰了试验结果的统计和处理，所以TCEP加⼊浓度为 (责任编辑：qin) |