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1材料与方法

1。1实验材料

1。1。1样品

实验室周围的土壤、淤积污水、实验室小白鼠的粪便

1。1。2实验仪器

电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；冰箱：青岛海尔电器有限公司；超低温冰箱：日本Sanyo公司；高压蒸汽灭菌锅：致微仪器有限公司；恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；恒温振荡器：太仓市实验设备厂；超净工作台：苏州净化设备有限公司；摇床培养箱：上海精宏实验设备有限公司；离心机：德国eppendorf公司；牛津杯：东台市昌吉仪器设备厂；PCR仪：杭州博日科技有限公司等。

1。1。3试剂

胰蛋白胨：国药化学试剂有限公司；酵母提取物：国药化学试剂有限公司；琼脂粉：国药化学试剂有限公司；氯化钠：生物工程（上海）有限公司；氯化钙：国药化学试剂有限公司；葡萄糖：国药化学试剂有限公司；无水乙醇：国药化学试剂有限公司；草酸铵结晶紫染液：国药化学试剂有限公司；95 %乙醇：国药化学试剂有限公司；牛肉浸膏：国药化学试剂有限公司；上游引物27 F：上海桑尼生物科技公司；下游引物1492 R：上海桑尼生物科技公司；甘油：国药化学试剂有限公司；TAE：生物工程有限公司等。

1。1。4培养基

（1）MRS培养基的制备流程：在锥形瓶中依次加入蛋白胨10。0 g、牛肉膏3。0 g以及氯化钠5。0 g，制备固体培养基还需加入琼脂粉10。0 g，最后加水定容至1。0 L。 

（2）LB培养基的制备流程：在锥形瓶中依次加入胰蛋白胨5。0 g、酵母提取物10。0 g以及氯化钠10。0 g，制备固体培养基还需加入琼脂粉10。0 g，最后加水定容至1。0 L， 

（3）PDA培养基的制备流程：将200。0 g马铃薯去皮，用刀切碎，放入大烧杯中加水煮沸，大约20 min 后，用双层纱布过滤，保留上清液，再加入20。0 g 葡萄糖，溶解后加水定容至1。0 L，制备固体培养基还需加入琼脂粉10。0 g。文献综述

上述制备好的培养基需在121 ℃，0。10 MPa的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min，冷却后保存于4 ℃的冰箱，以备实验使用。

1。2实验方法

1。2。1乳酸菌的分离

称取固体样品0。20 g，迅速倒入装有玻璃珠的离心管中，再加入20。0 ml的蒸馏水，振荡5 min左右，充分打散样品，即为10-2的样品悬液。再用接种针以无菌操作从10-2的样品悬液中沾取少量样品，在MRS+3。0 %CaCO3培养基上划线分离。在37 ℃恒温培养箱培养24 h后挑取单菌落，经多次划线分离后进行镜检，确保形态单一后进行扩大培养，获得单一菌种，并用甘油保存菌种存于-20 ℃。

制备液体样品悬液时，先用移液器吸取500 μl液体样品放入装4。5 ml无菌水的离心管中，混合均匀，制成10-1的样品悬液，再从10-1的样品悬液中吸取500 μl液体样品放入另一只装有4。5 ml无菌水的离心管中，混合均匀，最终制成10-2的样品悬液。其余步骤同上。

1。2。2抑菌活性测定