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摘    要目前在我国植物双生病毒病害的发生频率逐渐频繁，造成严重的农业危害，需要我们对其进行减灾防控的研究。单链环状的双生病毒基因组所编码的复制起始蛋白（Rep），是病毒起始复制必不可少的组件。已有的研究表明非洲木薯花叶病毒（ACMV）的Rep蛋白基因结构与其功能密切相关，例如在ACMV的序列中，一个潜在的细胞周期蛋白间相互作用的基序（RXL）与已知的视网膜母细胞瘤蛋白植物同源的相互作用（FRBR），可能是细胞周期的一个替代链接控件。野生型Rep的表达诱导了这个基序的变异，变异致使裂殖酵母消除了再复制。这表明Rep通过RXL与一个或多个酵母蛋白相互作用。RXL基序对烟草植物的病毒感染至关重要，因为在感染性克隆中这一基序的变异阻止任何症状性感。90176

对于ACMV中的Rep蛋白的基因序列里发生单核苷酸的突变后，该突变位点对病毒复制的影响程度可以利用这一系统来研究，从而可以研究病毒复制与病毒分子结构的互作调控的机制。我们计划利用Overlapping PCR技术人为构建Rep蛋白的点突变体，然后通过农杆菌接种来验证其复制功能是否发生变化，从而把突变的结构与蛋白的功能相联系，希望获得有意义的基因结构序列与作用域。

Geminiviruses encode a replication-initiator protein(Rep) is required for virus replication。 A potential cyclin interaction motif (RXL) in the sequence of African cassava mosaic virus Rep may be an alternative link to cell cycle controls to the known interaction with plant homologs of retinoblastoma protein (pRBR)。Mutation of this motif abrogated rereplication in fission yeast induced by expression of wildtype Rep suggesting that Rep interacts via its RXL motif with one or several yeast proteins。 The RXL motif is essential for viral infection of Nicotiana benthamiana plants, since mutation of this motif in infectious clones prevented any symptomatic infection。源Q于W优E尔A论S文R网wwW.yOueRw.com 原文+QQ75201,8766

Single nucleotide mutation of ACMV Rep gene can influence the viral replication。 In previous works we constructed a pORI2 system for studying the procession of ACMV viral replication。 In this experiment, we plan to construct variant Rep mutant with Overlapping PCR technology and the interaction between the host plant and viral replication would be checked by this pORI2 system。

毕业论文关键词： 双生病毒； 复制起始蛋白； 病毒复制

Keyword: Geminiviruses； Rep； virus replication

目    录

引言 4

第一章 ACMV 复制蛋白基因定点突变体的构建 6

引言 6

一、 实验材料 7

二、 分子生物学试剂 8

三、 实验方法与步骤 8

1。 引物设计： 9

2。 ACMV Rep基因的扩增及纯化，获得Overlapping PCR的前体模板 10

3。 利用纯化后的Overlapping PCR的前体模板片段进行Overlap PCR反应 12

4。 对正确的PCR产物电泳片段进行切胶回收 13

5。 构建pCAMBIA2300/Rep突变体载体的反应步骤 14

6。 (责任编辑：qin)