肺炎克雷伯杆菌噬菌体的分离及受体的鉴定(2)
时间:2018-07-17 21:01 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
属中最为重要的一类菌，俗称肺炎杆菌[1]。肺炎克雷伯杆菌极易引起医院内各种术后感 染，是重要的病原菌之一，近年来由该菌引起的器官和组织的脓肿在院内的报告不断出 现。 由于抗生素的不合理使用， 多重耐药细菌便随之成为了人和动物生命的重要威胁[2]。 肺炎克雷伯杆菌耐药机制主要是产生β-内酰胺酶，但由于人们不听医嘱滥用β-内酰胺类 等广谱抗菌素，再加上多重耐药肺炎克雷伯杆菌往往极易携带编码超广谱β-内酰 （extended-spectrum beta-lactamases, ESBLs）质粒，抗生素治疗已存在很大的局限性[3]。 从这一方面来看，噬菌体作为天生的“细菌的病毒”这一点使得噬菌体疗法的优越性凸显 了出来。因此，分离纯化新的噬菌体菌株并进行肺炎克雷伯杆菌噬菌体受体的鉴定，对 于研制噬菌体混合制剂以治疗病原菌引起的疾病意义重大。 针对肺炎克雷伯杆菌的噬菌体治疗的研究已有很多报道，截止 2016 年 2 月 20 日， NCBI 数据库目前报道过的全基因组的肺炎克雷伯杆菌噬菌体有 22 株，它们从世界各 地分离而来[4]。噬菌体是自然界中一类常见的病毒，宿主为细菌，却对动植物无害，通 常在一些充满细菌菌落的地方，如：泥土、动物的内脏里，就可以发现噬菌体的踪迹， 在实验室中采用双层平板法可极易分离纯化而得。噬菌体被分为温和噬菌体和烈性噬菌 体，主要是根据与宿主菌作用模式的不同：温和噬菌体侵入相应宿主细胞后，因为其基 因组会随之整合到宿主菌的基因组上，并随后者的复制而开始同步复制[5]，携带的基因具有影响宿主细菌的表型和行为的能力，这种温和噬菌体的侵入并不能够裂解宿主细胞。 相比温和噬菌体，烈性噬菌体能在短时间内不间断进行完吸附、侵入、增殖（复制与生 物合成）、成熟（装配）和裂解（释放）5个阶段而实现其繁殖。其中，噬菌体的裂解作 用过程复杂，穿孔蛋白-裂解酶途径是其经典模式[6]。裂解性噬菌体对其特异性宿主细菌 有着十分高效的裂解能力，再加上其感染细菌的机制与抗生素的杀菌作用有着天壤之别， 因此能研制成十分理想而高效的混合制剂，用作治疗病原菌引起的疾病。 本研究筛选了一株针对多重耐药肺炎克雷伯杆菌的噬菌体，对其生物学特性如宿主 谱、一步生长曲线、吸附率等进行研究。同时，为了进一步了解该噬菌体感染肺炎克雷 伯杆菌的机制，还利用转座子插入技术筛选噬菌体感染该肺炎克雷伯杆菌的受体基因， 并通过滴板、噬菌体增殖以及吸附率实验对受体进行鉴定，通过随机引物 PCR 以及测 序分析鉴定了受体基因，为噬菌体防治肺炎克雷伯杆菌引起的感染奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 实验中用到的 24 株肺炎克雷伯杆菌由南京军区总医院提供，二亲接合供体菌 BW20676 由南京农业大学微生物实验室提供。 1.1.2 主要试剂 （1）液体 LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，加去离子水至 1 L， 调pH至 7.4，121 ℃ 灭菌15 min。 （2）0.7%半固体 LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂粉7 g， 加去离子水至1 L，调 pH至7.4，121 ℃ 灭菌 15 min。 （3）1.5%固体 LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g， 加去离子水至1 L，调 pH至7.4，121 ℃ 灭菌 15 min。 （4）SM 保存液：100 mmol/L NaCl，8 mmol/L MgSO4，50 mmol/L Tris-HCI (pH7.5)， (责任编辑：qin) |