肺炎克雷伯杆菌噬菌体的分离及受体的鉴定(3)
时间:2018-07-17 21:01 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
0.01%明胶，121℃ 灭菌15 min 后 4℃保存备用。 （5）双层琼脂培养基： 上层培养基：0.7%半固体 LB培养基 下层培养基：1.5%固体 LB培养基 每次倒上层板时，加入 60 μL的肺炎克雷伯杆菌于 3 mL 0.7%的半固体 LB培养基。 该培养基用于噬菌体的分离纯化以及宿主谱等的测定实验。 （6）三抗 LB培养基： Amp100Sm100Km50+LB 液体/（半）固体培养基： LB 液体/固体培养基+氨苄青霉素 储存浓度100 mg/mL，使用浓度100 μg/mL；链霉素储存浓度 100 mg/mL，使用浓度100 μg/mL，卡那霉素储存浓度 50 mg/mL，使用浓度 50 μg/mL，用于生物学特性研究等实 验。 Amp100Sm200Km50+LB 液体/（半）固体培养基：LB液体/固体培养基+氨苄青霉素储 存浓度 100 mg/mL，使用浓度 100 μg/mL；链霉素储存浓度 200 mg/mL，使用浓度 200 μg/mL，卡那霉素储存浓度50 mg/mL，使用浓度 50 μg/mL，用于筛选受体的实验。 （7）提 DNA主要试剂： 溶液 Ι： 50 mM 葡萄糖，25 mM Tris-HCl(pH 8.0)，10 mM EDTA(pH 8.0） 溶液 ΙΙ：NaOH 1 mL，10% SDS 1 mL，加 ddH2O至10 mL。使用前临时配置。 溶液 ΙΙΙ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5 M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加 ddH2O至 500mL。4℃保存备用。 TE：10 mM Tris-HCl（pH 8.0） ，1 mM EDTA（pH 8.0） 。1 M Tris-HCl（pH 8.0）1 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）0.2 mL，加ddH2O至100mL。121 ℃ 灭菌 15 min 后4℃保 存备用。 1.1.3 污水样品 污水样品采自南京农业大学西门生活污水。 1.2 实验方法 1.2.1噬菌体的分离与纯化 （1）宿主菌的准备 将 24 株冻存的肺炎克雷伯杆菌复苏后，在固体琼脂平板上分区划线，置于 37℃培 养箱培养过夜，传代直到菌株状态良好后挑取单一菌落，接种于 LB 液体培养基， 于37℃ 摇床振荡培养到细菌的对数生长期。 （2）水样处理 取未进行处理的南京农业大学西门生活污水原液 400 mL，加入 CaCl2固体后使得终 浓度为 1 mmol/L，在 4℃的条件下 10，000 rpm × 5 min离心，保留上清液，除去沉淀 待用[7]。 （3）噬菌体分离 取保留的上清液 200 mL 于锥形瓶中，加入 24 株肺炎克雷伯杆菌的菌悬液各 1mL 和 LB 液体培养基 50 mL，置于 37℃摇床振荡培养 12~16 h。次日，在 4℃的条件下， 8000 rpm×2min 离心沉淀细菌，取上清用 0.45 μm 过滤除菌后，再用 0.22 μm 过滤器再 次过滤后，取过滤最后一次含噬菌体的液体 20 μL至试管液体培养基中 37℃培养过夜， 观察试管中若含杂菌，则需进行再一次过滤。 （4）纯化 为了分离到形状相近、大小比较均一的噬菌斑，需要进行进一步纯化，本实验用双 层琼脂平板法纯化。先将双层琼脂培养基平板置于 42℃培养1~2 h后，再用灭菌后的牙 签蘸取倍比稀释后的噬菌体菌液进行分区划线，42℃培养5~6 h后观察噬菌斑形成情况 [8]。重复此纯化过程 3~4次，即可获得形状相近、大小比较均一的噬菌斑。 (责任编辑：qin) |