和缓艾美尔球虫1A蛋白基因的克隆表达(3)
时间:2018-08-02 12:54 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
5×Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）：称量Tris15.1 g，Glycine 94g，SDS 5.0 g加入约800 mL去离子水，溶解后，补足水定容至1L，室温保存。 2×SDS loading buffer：将1mol/L Tris-HCl（pH 6.8）1mL，10% SDS 4mL，0.02g溴酚蓝，甘油2mL，250 μL β-巯基乙醇，最后加入去离子水定容至10 mL。 考马斯亮蓝R-250染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，量取250 mL异丙醇，100 mL冰乙酸，加入约650 mL去离子水，搅拌均匀后用滤纸除去颗粒物质，室温储存备用。 考马斯亮蓝染色脱色液：量取冰乙酸100 mL，乙醇100 mL，按1比1混合，加去离子水定容至1L，充分混合后使用。 无K+PBS：19mL0.2mo1/LNaH2PO4和81mL0.2mo1/LNa2HPO4混匀后加入约900mL去离子水，定容到1L。 0.1mol/L NaOH：称取NaOH 0.8g，加入150mL的去离子水中，待其溶解后，定容到200mL常温保存备用。 0.1mol/L HCl：需要在通风橱中配置该试剂，取0.9mL浓盐酸，加入90mL的去离子水中，定容到100mL常温保存备用。 蛋白纯化需要用到的试剂 包涵体Binding Buffer：首先称取 Urea 240 g，NaCl 14.6 g，咪唑 0.68 g，倒入烧杯中，再加入50 mL的无K+PBS，搅拌溶解，最后加去离子水定容至500 mL，用0.22 µm滤膜抽滤，过滤掉其中的细菌和杂质，室温下保存备用。 包涵体Elution Buffer：首先称取 Urea 240 g，NaCl 14.6 g，咪唑17 g，倒入烧杯中，再加入50 mL的无K+PBS，最后加去离子水定容至500 mL，调节pH至7.4，用0.22 µm滤膜抽滤，过滤掉此中的细菌和杂质，室温保存。 上清Binding Buffer：包涵体Binding Buffer不加Urea，其他相同。 上清Elution Buffer：包涵体Elution Buffer不加Urea，其余相同。 1. 1. 4 仪器设备 超净工作台；低速大容量离心机（无锡瑞江离心机厂）；高速大容量低温离心机（Beckman）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器；2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL的移液枪（GILSON公司）；两台PCR扩增仪（HYBAID公司）；核酸胶电泳仪（DYY-11B，北京市优尔一仪器厂）；恒温振荡器，用于摇菌（江苏太仓实验设备厂）；隔水式恒温培养箱，（上海森信实验设备有限公司）；超声破碎仪（南京先欧生物技术公司）；涡旋震荡机；电热恒温水槽（DK-8D，上海森信实验仪器有限公司）；常温离心机和冷冻离心机（Eppendorf）；蛋白胶电泳仪（Bio-Rad）；凝胶成相仪（BIO-RAD）。 1. 2 1A蛋白基因的PCR克隆 根据GenBank中和缓艾美耳球虫1A基因序列，应用Primier 5.0软件进行设计1A基因的扩增引物，设计出来的引物P1和P2的5ˊ端分别含BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点。引物送至江苏省琴科生物有限公司合成。 以所得到的反转录产物为模板，对过氧化物酶基因进行扩增。充分混匀后瞬离，于PCR仪上94℃预变性 5min，94℃变性 30s，58℃退火30s， 72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min，16℃保存1h。取5μL PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。 1. 3 原核表达载体的构建 提取质粒，测量浓度，计算，分别用BamHⅠ和Not Ⅰ双酶切1A片段和原核表达载体pSmart-I(+)，回收1A基因和pSmart-I(+)载体片段，再次测量浓度，按照公式，计算出目的基因和载体片段的比例，用Ligation Mix连接过夜，第二天将连接产物转化到大肠杆菌BL21（DE3）。 细菌转化的步骤：将前一天的连接产物加入到200μL大肠杆菌 BL21感受态细菌中，切记用移液枪吹吸均匀，如果所用的BL21感受态细菌浓度过高，可以用0.1mol/L的CaCl2溶液稀释后使用。吹吸均匀后将其用封口膜封好，在冰上放置30min。30min后将 EP管移至 42℃水浴，90s 后快速转移至冰浴中，冰浴90s~2min。冰浴取出后，在超净台中加入0.8~1mL不含有抗生素的LB液体培养基，用封口膜包好，放置到37℃恒温摇床（150r/min)培养45~60min。然后放入离心机，以4℃ 5000r/min离心 5min，将离心所得的上清，在超净台中用移液枪弃去800μL ，将剩余的大约200 μL菌液重悬，用移液枪全部打到含有氨苄青霉素的固体培养基上，用酒精灯烧过冷却的玻璃棒均匀涂布菌液至涂干，平板倒置，在37℃恒温培养箱中培养过夜，约12-16h后来观察菌落生长情况，不能时间太久，会使菌落长得过大过密，不方便进行下一步挑菌实验。 (责任编辑：qin) |