和缓艾美尔球虫1A蛋白基因的克隆表达(4)
时间:2018-08-02 12:54 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
次日观察后，任意挑取单菌落，摇菌，6-8h后提取质粒，进行双酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的质粒送至江苏省琴科生物科技有限公司进行序列测定。 1. 4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 接种2-3管，一管空白对照。然后在37℃的条件下振荡培养至对数生长期（约3h），3h后观察菌液的浓度，放在报纸上能遮住报纸上本身的字迹时，按1:1000加入IPTG（终浓度为1mmol/L）进行诱导，向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM或1.0mM，分别在37℃和15℃，220rpm振摇4h和16h，诱导融合蛋白表达用PBS反复洗涤3次，注入蛋白loading buffer，煮样15min，进行SDS-PAGE分析，电泳前要将样品离心12000r/min离心5min。 1．5 重组蛋白的大量表达以及纯化 首先，在超净台中将10μL阳性菌液，5μL氨苄青霉素（100mg/mL）加入5mL 新配置的LB液体培养基中，接种2管备用，大量表达时，在1L的LB液体培养基中，按1:1000加入氨苄抗生素，然后将5ml菌液全部加入装有1L的LB液体培养基的锥形瓶中。放入大型的恒温振荡器，振荡培养3h，待菌液成云雾状时可以按1:1000加入IPTG诱导表达。 诱导结束后，将菌液装入清洗烘干的500mL离心瓶中，使用高速大容量离心机，室温5000rpm离心15h，弃去上清，注意配平，大约离心两次。随后用pH7.4 PBS 把得到的沉淀洗涤两次，重新加入PBS时注意要将菌体充分重悬，每次洗涤完，放入高速大容量离心机5000rpm离心30min，弃上清。将离心得到的沉淀加入50mL收集管中，超声破碎。将破碎后的菌体放入离心机中，5000rpm离心45min后，将上清和包涵体分别装入不同的50mL收集管中，做好标记，然后分别加入上清Binding Buffer和包涵体Binding Buffer溶解上清和沉淀，通过His 标签蛋白纯化柱（GE公司的His Taq亲和层析蛋白纯化柱）纯化重组蛋白。具体步骤如下： 1）溶解的包涵体4℃放置溶解过夜；分别把溶解后收集的上清和包涵体依次经过0.45μm、0.22μm滤膜过滤过大的菌体碎片和杂质； 2）然后用25-50mL的双蒸水清洗His-Trap纯化柱，流速2mL/min； 3）用25-50 mL的上清 Binding Buffer、包涵体 Binding Buffer 通过相应的 His-Trap纯化柱先使柱子平衡，流速2mL/min；把处理好的上清和包涵体蛋白，加入其对应的His-Trap 纯化柱，流速1mL/min； (责任编辑：qin) |