利用VIGS方法分析TaJRL29的抗赤霉病功能(3)
时间:2018-08-02 16:01 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1．1．2 溶液及培养基的配制 LB培养基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，ddH2O定容，121℃灭菌20min。固体培养基加1%琼脂，抗性培养基加对应的抗生素。保存于4℃冰箱。 土豆（马铃薯）培养基：土豆（洗净，去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，过滤之后ddH2O 定容至1000mL，121℃灭菌20min，保存于4℃冰箱。 绿豆培养基：绿豆65g，煮沸5min，定容1200mL，121℃灭菌20min，保存于4℃冰箱。 质粒提取液：P1：25mL 1mol/L Tris-HCl，10mL 0.5mol/L EDTA，定容至500mL，调PH=8.0，121℃灭菌20min，并加入RNase（1mg/μL）。P2：0.4mol/L NaOH，2% SDS按体积比1:1混合，现用现混合。P3：57.5mL CH3COOH，147.225g CH3COOK，定容至500mL，调PH=5.5，121℃灭菌20min。 TBE（5×）缓冲液：54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA（PH=8.0），ddH2O定容至1L，常温保存。 SDS提取缓冲液（DNA提取液）：0.1 mol/L Tris-HCl（PH=8.0），0.05mol/L EDTA（PH=8.0），1.25% SDS，0.5mol/L NaCl，3.8g/L亚硫酸氢钠定容。 70%乙醇：70mL无水乙醇加入ddH2O定容至100mL。 CaCl2：0.1mol/L，1.11g CaCl2固体加ddH2O配成100ml水溶液，121℃灭菌20min后4℃保存。 DEPC（焦碳酸二乙酯）水：0.1%，吸取1mL DEPC，ddH2O定容至1000mL，利用磁旋搅拌机充分混匀（30min），121℃灭菌40min，室温避光保存。 FES缓冲液：glycine 50mM，K2HPO4 30mM，Na4P2O7 1%，bentonite 1%，celite1 %，DEPC水定容，121℃灭菌20min，常温避光放置。 1．2 试验方法 1．2．1 RNA的提取与反转录 取开花期望水白（WSB）和中国春（CS）的各组织提取RNA，提取方法参照Invitrogen公司Trizol试刑产品说明书。将材料在液氮中充分研磨，然后加入到含1ml Trizol试剂的1.5ml离心管中，充分振荡混勾，室温放置5min，4℃12000rpm离心5min。取上清中加入等体积酚/氯仿充分混匀，4℃12000rpm离心15min。取上清用酚/氯仿抽提两遍，然后把上方无色水相转移到新的1.5ml离心管中，用两倍体积无水乙醇沉淀RNA，室温放置l0min后，12000 rpm离心l0min，去上清，用75%乙醇将沉淀的RNA清洗2次。室温干燥后，将沉淀溶于适量DEPC水中-80℃保存。在RNA充分溶解后。取2μL RNA样品在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测质量。用紫外分光光度计（Ultrospec 2100 pro Amersham Pharmacia England）测定A260/A280值，估计样品浓度。 参照Promega公司反转录试别盒说明书进行反转录。取3μg RNA， 1 μ1 Oligo d (T)，适量的DEPC水混匀后，65℃温育5min后迅速置于冰上，然后加入4μ1 5×第一链合成缓冲液，1μl 10mM dNTP混合液，1μl RNase，l00U M-MLV反转录酶和适量的DEPC水，调整至总体积为20μ1。在37°C下温育90min，最后70℃加热15min终止反应，-20℃保存以备用。 1．2．2 植物基因组DNA的提取 取适量植物叶片，放入2.0mL的离心管中，液氮速冻，用磨样器迅速研磨成粉末，加入预热的SDS提取缓冲液600μL，温和混匀。65℃水浴30min，水浴过程中每隔 10 min上下颠倒混匀一次。水浴后的样品12000rpm，4℃，离心4min后，将上清移入另一离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（体积比为24:1），上下颠倒混匀10min。12000rpm，4℃，离心 10 分钟，将上清移入另一离心管中，加入1.5倍体积冻酒精（-20℃预冷），轻轻混匀，12000rpm，4℃，离心6分钟，弃上清。加入1mL 70%乙醇洗涤，12000rpm，4℃，离心5min，倒掉上清液，风干沉淀，加入适量ddH2O溶解备用。 1．2．3 大肠杆菌DH5α感受态的制备 从37℃培养10-12h的平板中挑取一个单克隆菌落，转到一个含有100mL LB培养基的1L三角瓶中，于37℃，220rpm的条件下培养约3h（OD600≈0.5）。将菌液转移到一个无菌并用冰预冷的50mL的聚丙烯管中，在冰上放置10min，4000rpm，4℃离心15min，去上清。加入10mL预冷的CaCl2溶液，轻悬浮菌体，冰上放置10min后，4℃，4000rpm离心15min，弃上清，加入10mL预冷含15%甘油的0.05mol/LCaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞悬浮液。分装为100μL/管，保存于-80℃备用。 (责任编辑：qin) |