水稻斑马叶突变基因zebra leaf3的精细定位(5)
时间:2018-10-17 11:45 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
Chl a：Ca＝12.21 A663-2.81 A645； Chl b：Cb＝20.13 A645-5.03 A663； β-胡萝卜素浓度Cx+c＝（1000 A470-3.27 Ca-104 Cb）/229 计算得出细胞色素的浓度后(mg.L-1)，然后换算成单位鲜重的叶片所含的色素的量(mg.g-1)。 1.6 透射电镜观察叶绿体结构 剪取三叶期的野生型9311和zl3突变体的斑马叶的横白条纹处进行透射电镜(Transmission Electron Microcopy, TEM)的超微结构观察，叶片横切为2mm大小。随后2.5%的戊二醛溶液（25%戊二醛 10 mL, 0.2 M pH 7.2 Na2HPO4-NaH2PO4 50 mL, ddH2O定容至100 mL，4℃避光保存）室温固定24 h后4℃保存；接着1% OsO4固定；然后醋酸氧铀染色，丙酮梯度脱水（50% - 70% - 80% - 90%，每梯度15 min；100%丙酮脱水30 min，重复3次）；最后包埋在环氧树脂SPURR中聚合，LEICA超薄切片机切成50-90 nm的切片。醋酸铀染色后在Hitachi H-7650透射电子显微镜下观察叶绿体结构并拍照。 1.7 植物总DNA的提取 将zl3/02428配制的F2群体发苗，从中挑取极端单株，取回后保存于-20℃冰箱内。采用SDS方法提取总的DNA。 溶液的配制 SDS提取液 NaCl 29.25 g SDS 12 g pH8.0，1M Tris-HCl 100 mL pH8.0，0.5M EDTA 50 mL 加入800 mL ddH2O，置于65℃水浴锅中充分溶解，溶解后加水定容至1 L，备用。 醋酸钾(KAC) 冰醋酸 29.5 mL，ddH2O 80 mL ddH2O，混匀后置于冰上，用KOH调节pH至4.8，最后定容至100 mL，低温避光保存，备用。 DNA提取 1) 将水稻幼苗置于2.0 ml离心管中，液氮冻15min后磨成粉末。 2) 加入600 µl预热好的SDS提取液，混匀后置于65 ℃水浴锅中30 min，间歇振荡2-3次。 3) 加入150 µl -20℃预冷的醋酸钾溶液，混匀后摇匀后-20℃冰浴30 min。 4) 加入600 µl氯仿-异戊醇(24:1)溶液，上下颠倒2-3次，混匀后置于摇床上120 rmp/min 30 min。 5) 12000rpm/min 离心10min，吸取400ul上清至新的1.5ml离心管中，加入800ml -20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃ 30min。 6) 4℃，12000 rmp/min，离心5min，倒掉上清，置于超净工作台上吹干。 7) 每管加入200 µL 的ddH2O溶解室温溶解2h，-20 ℃保存，备用。 (责任编辑：qin) |