产多糖耐镉芽孢杆菌的筛选及其胞外聚合物的组成(3)
时间:2018-11-01 17:55 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1．1．3 主要试剂与溶液 ① 葡萄糖标准溶液[8] 准确称取葡萄糖100 mg，倒入250 mL烧杯中，加入少量去离子水并用玻璃棒搅拌溶解后，转移至容量瓶，并多次用去离子水冲洗烧杯及玻璃棒，将清洗后的去离子水一并用玻璃棒引流至容量瓶中，加去离子水，定容至100 ml，即得1 mg/mL的葡萄糖溶液。用5 ml移液管准确移取5 mL的1 mg/mL的葡萄糖溶液，共移取10 mL至100 mL容量瓶中，加入去离子水定容至100 mL，摇匀后即得100μg/mL的葡糖糖标准溶液，标记备用。 ② 苯酚溶液 准确称取苯酚90 g，倒入250 mL烧杯中，加入10 mL去离子水后一边加热一边用玻璃棒搅拌至溶液呈无色透明，即得90%苯酚溶液。用5 mL移液管准确移取90%苯酚溶液5 mL至100 mL棕色瓶中，加入去离子水45 mL，摇匀后即得9%的苯酚溶液，标记后备用。 ④ 标准蛋白质溶液[9] 准确称量标准的牛血清白蛋白10 mg，倒入到250 mL烧杯中，并用玻璃棒搅拌溶解后，转移至容量瓶，并多次用去离子水冲洗烧杯及玻璃棒，将清洗后的去离子水一并用玻璃棒引流至容量瓶中，加去离子水，定容至100 mL，使最终试剂浓度为100μg/mL。盖上容量瓶塞，上下反复颠倒，使牛血清白蛋白溶液充分混匀。将配置好的牛血清白蛋白溶液转入到100 mL三角瓶中，标好标记后待用。 ⑤ 革兰氏染液 草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红复染液。 ⑥ 50×TAE Tris 121 g，冰醋酸28.55 g，0.5 M EDTA（pH 8.0）50 mL，ddH2O溶解并定容至500mL。 ⑦ 重金属溶液 将CdCl2.2.5H2O配制成浓度为5 g/L的Cd2+母液。 1．1．4 主要仪器设备 37℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、振荡培养箱、无菌超净工作台、手提式灭菌锅、恒温水浴锅、涡旋震荡器、可见分光光度计、高速冷冻离心机，光学显微镜等。 1．2 实验方法 1．2．1 产多糖芽孢杆菌的筛选 采集来自南京栖霞上矿区农田土样，称取10 g土样加入90 mL去离子水，充分混匀后，80℃水浴30 min，置于摇床(160 r/min)上恒温(30℃)摇瓶培养。吸取1 mL菌悬液进行系列梯度稀释涂布，稀释梯度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6，吸取10-3,10-4,10-5,10-6梯度下菌悬液各100 μL，涂布于含有100 mg/L镉（Cd）浓度的LB平板上，将平板置于30℃培养箱过夜培养。根据培养基中菌落表面及形态，挑选优尔株菌在LB培养基上进行分离纯化后，挑选单菌落于有氮培养基上划线，隔夜培养后，选出生长较好的三株菌低温保存。 1．2．2 菌株的菌落和菌落形态特征 将保存的菌株在LB培养基上划线得到单菌落，观察单菌落边缘形状、大小、隆起情况、表面形态、菌落颜色、透明度等情况。 1．2．3 菌株革兰氏染色 将菌株在LB平板上培养16 h，然后制片进行革兰氏染色。观察革兰氏染色情况并记录。 1．2．4 生长曲线的测定[10] 挑选低温保存的菌株于5 mL LB液体培养基试管中，摇床活化18 h。配置LB液体培养基，添加CdCl2母液，使Cd2+浓度梯度为50、80、100、120 mg/L（以纯Cd2+计），另以不含任何重金属离子的LB液体培养基作对照，将活化后的菌液按1%的接种量分别接种于上述培养基中，置于摇床(160 r/min)上恒温(30℃)摇瓶培养。在菌体胁迫培养过程中，每隔2 h，以LB液体培养基作对照，在波长为600 nm的紫外分光光度计下测其光密度值，绘制菌株在不同浓度重金属胁迫下的生长曲线。 1．2．5 胞外聚合物(EPS)的提取及组成测定 ① 胞外聚合物(EPS)的提取[11] (责任编辑：qin) |