木霉漆酶基因的原核表达研究
时间:2019-09-03 12:46 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
| 摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化还原酶，在多种生物合成和降解中起着重要作用。本研究对已构建好的重组质粒PET52b-Laccase进行了木霉漆酶基因的原核表达研究。结果表明，原核表达的漆酶具有一定的活性，30℃、IPTG诱导5h时所表达的漆酶酶活最高，达到59.51U/L；Cu2+对漆酶酶活有诱导作用，当Cu2+浓度为2.5mM时，酶活达到最高（22.04U/L），而Fe2+与Mn2+对漆酶酶活有抑制作用，且Fe2+的抑制作用较显著；另外，所表达漆酶对考马斯亮蓝、甲基蓝和孔雀石绿三种染料具有一定的脱色作用，且对考马斯亮蓝脱色效果最显著，50℃、脱色24h时脱色率可达34.87%，对孔雀石绿次之（24.58%，60℃），再是甲基蓝（22.47%，50℃），而对溴酚蓝的脱色效果不明显，脱色率仅为5.516%（50℃）。40445 毕业论文关键词：木霉；漆酶；原核表达；酶活性；脱色 Prokaryotic expression of laccase gene from Trichoderma Abstract: Laccase is a kind of polyphenol oxide reductase containing copper, which plays an important role in many kinds of biosynthesis and dye degradation. At present, the prokaryotic expression of the Trichoderma laccase gene built in plasmid PET52b was studied. The results showed that, the expression enzyme of laccase has some certain activity, and the highest enzyme activity reached to 59.51U/L at 30 oC under IPTG induction for 5h. Moreover, Cu2+ induced the laccase enzyme activity and the activity reached to the highest (22.04U/L) when the concentration of Cu2+ was 2.5mM. However, Fe2+ and Mn2+ had an inhibition on laccase activity, and especially Fe2+. Furthermore, the expression enzyme showed decolorization ability for coomassie brilliant blue, methylene blue and malachite green three dye, with the highest decolorization rate of 34.87% (at 50℃), 24.58% (at 60℃), 22.47%(at 50℃), 5.516% (at 50℃), respectively, after 24 hours of inoculation. Key word: Trichoderma; laccase; prokaryotic expression; enzymatic activity; decolorization 目 录 摘 要 1 引言 2 1. 材料与方法 2 1.1 实验材料与试剂 2 1.1.1 实验材料 2 1.1.2 实验试剂 2 1.2 实验仪器 3 1.3 实验方法 3 1.3.1 实验思路 3 1.3.2 药品的配制 3 1.3.3 菌种的活化 4 1.3.4 木霉漆酶基因原核表达的诱导 4 1.3.5 SDS-PAGE电泳检测 5 1.3.6 木霉漆酶酶活测定及温度与金属离子对其活性的影响 6 1.3.7 木霉漆酶对染料的脱色作用 7 2. 结果与分析 7 2.1 SDS-PAGE电泳检测 7 2.2 木霉漆酶的酶活测定 8 2.3 温度对木霉漆酶酶活力的影响 10 2.4 金属离子对木霉漆酶酶活力的影响 11 2.5 不同温度下漆酶对不同染料的脱色情况 12 3. 讨论 15 参考文献 15 致谢 17 木霉漆酶基因的原核表达研究 引言 随着科学技术的快速发展，人们的生活节奏也不断加快。环境问题逐渐成为21世纪人类所面临的几个重大问题之一。目前，我国化工业污水对环境的污染十分严重，其中纺织印染废水染料残留量高、色度深、危害大，因此如何利用便捷有效方法处理这些染料废水已经十分重要[1]。这些化学污染物对周围环境、人类健康以及社会发展的危害也愈来愈大，环保成为人类共识和义不容辞的责任。 生物科技的迅速发展，在环境保护领域逐渐展示了巨大威力，酶在环境保护方面的应用发挥了重要作用，有着美好的前景[2]。漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，漆酶广泛存在于多种植物和菌类的分泌物中[3]。漆酶可存活于空气中，发生反应后仅有一种产物，就是水，因此本质上漆酶是一种环保型酵素[4]。另外，漆酶作用底物广，因此它在废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、环境监测业、废水处理以及杀虫剂的降解等领域具有重要的应用价值，漆酶的研究也因此成为科研工作者的热门课题[5]。目前，研究最多的主要是担子菌亚门的白腐真菌，而对木霉漆酶研究的较少。因此，研究木霉漆酶的作用将具有重要意义。 (责任编辑：qin) |