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Red重组系统共需要3种质粒:一种质粒是同源重组辅助质粒，其提供协助同源重组的exo、bet、gam3个基因，用于表达重组系统的3个蛋白;另一种质粒含有两侧带有翻转酶结合位点(flipaserecognitiontarget，FRT)的抗性基因，用作PCR模板;最后一种质粒为抗性基因消除质粒，其含有重组酶，用于消除染色体上同源重组的抗性基因[7]。

同源重组辅助性质粒pKD46[8]含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30°C培养时可以正常复制，而高于37°C时会自动丢失。在pKD46上还含有受ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，它们通过阿拉伯糖诱导表达，并携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记[9]。

1.2.2 Red同源重组的技术方法及技术难点

Red重组系统共需要设计两对引物，即带同源臂的抗性基因扩增引物和鉴定引物。带同源臂的抗性基因扩增引物可以扩增两侧带有FRT位点的抗性基因片段，并在FRT位点的外侧加入同源臂，其扩增产物可以通过同源重组将抗性片段替换掉拟敲除的目的基因[10]。

与Rec同源重组方法相比，Red重组系统的同源臂只需要36~60nt即可高效的完成重组，因此Red重组可以直接将同源臂设计在引物上，免去了添加酶切位点或重叠延伸PCR等操作。鉴定引物用于鉴定目的基因是否被成功地替换为抗性基因，通过PCR检测两个目的位点之间的距离判断菌体是否进行了重组，通常设计在同源臂外侧的基因上，但如果敲除基因片段与插入片段长度相似，则无法通过该方法进行检测。理论上，可以将鉴定引物分别设计在同源臂的内侧和外侧，但目前尚未有文献报道，可能是在PCR鉴定过程中无阳性对照的原因。

对于要敲除的目的基因，其引物同源臂的长度是影响重组效率的最主要原因[11]。同源臂短，可能造成敲除的失败或产生大量的假阳性结果。同源臂越短，通过抗性筛选到的转化子的假阳性就越多;而同源臂过长，则会造成引物合成的成本几倍或十几倍增长且合成时间过长，影响研究进度。目前，国内外通过Red重组进行基因修饰所使用的引物同源臂长度主要在40~60 nt之间。同源臂的长度影响重组率的高低主要和菌体内的核酸外切酶有关[12]。Gam蛋白虽然可以抑制RecBCD核酸外切酶活性，但由于其抑制作用并非完全抑制，RecBCD会留有一部分活性，而且体内还有其他核酸外切酶，例如，RecQ和RecJ。长度较短的同源臂容易被这些核酸外切酶降解，导致重组效率偏低。

Red重组中感受态细胞的优劣也是影响重组效率的关键因素之一[13]。许多文献都对制备感受态细胞时，L-阿拉伯糖的诱导浓度及诱导时间和转化后的复苏时间做了优化试验[14]。

近年来，Red重组已经发展成为一套比较成熟的重组系统，以重组效率高和方法简便著称[15]。对Red重组的改进方法主要是对Red载体系统的改造来提高其重组率。Red重组技术虽然已比较完善，但是对于Red重组的某些更深层次的机理还有待研究，例如，虽然我们已经知道Gam蛋白可与RecBCD核酸外切酶结合，抑制RecBCD核酸外切酶活性，然而其精确的抑制机制还不清楚，有待进一步研究[16]。目前，Red重组技术大多数应用于大肠杆菌的基因修饰中。有人曾在沙门氏菌(Salmonel la)，痢疾杆菌(Shigelaflexneri)等菌中利用Red重组进行基因敲除，但在其它菌种例如枯草芽孢杆菌中，还是运用其自身的重组系统，难摆脱其重组效率低、操作复杂等缺点。所以，如何对Red重组系统进行改造，使其可以在大多数细菌中运用将成为今后Red重组的主要研究方向。随着基因工程研究的不断深入，Red同源重组作为一种高效的打靶技术，其应用范围将越来越广泛，将使基因修饰(尤其是基因敲除技术)技术的发展得到进一步的完善。 (责任编辑：qin)