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1.2.3 Xer重组系统的应用

dif位点能够由大肠杆菌自身所含有的Xer重组酶进行识别，因此在基因删除方法中`优尔~文!论$文^网www.youerw.com运用dif位点取代FRT位点，在去除抗生素抗性基因时，不需要将携带外源重组酶基因的质粒转化于目的转化子并表达，可以简化实验操作[17] [18] 。然而，迄今为止，Bloor等研究者报道了应用Red重组系统-Xer重组系统成功删除大肠杆菌基因组中的一个基因; 其是否适用于基因组中多基因的删除及其基因删除效率等至今未有报道[19]。

1.3 本课题的研究思路和主要研究内容

在完成了对各种微生物基因组的测序以后，功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统，但是RecA重组系统操作复杂，重组效率低。最近建立了Red重组系统，该系统由3个蛋白组成:α蛋白(即λ核酸外切酶)，β蛋白，Gam蛋白。应用Red系统进行基因敲除，可以直接利用线性打靶DNA，两侧同源臂长度在35～60bp即可发生同源重组，且重组效率高。本课题的目的是将大肠杆菌Top10F'的乳糖通透酶LacY基因删除，原理如图1.1（中文）和1.2（英文）所示：

图1.1 大肠杆菌染色体基因删除方法原理

首先在液体培养基培养大肠杆菌MG1655，用SDS法提取得到MG1655大肠杆菌的总DNA，用合适的引物knock1和knock2扩增目的LacY（PCR)，将PCR产物与合适的载体（pUCm-T载体如下图1.3）连接。将所获得的重组质粒用AflII限制性内切酶酶切，去除目的基因中部部分序列，在与dif-Gm-dif片段连接，构建获得含有突变盒片段的重组质粒。将含有突变盒片段的重组质粒用EcoRI限制酶酶切线性化（避免使用突变盒片段上具有的酶切位点论文网）。将线性化片段进行胶分离去除环形质粒，以该片段为模板，用引物Knock1和Knock2进行PCR扩增，PCR产物纯化后获得高浓度突变盒片段。

另一方面，将质粒pKD46转化（电转化或化学转化）到Top10F'感受态大肠杆菌中，得到含pKD46(图1.4)的宿主大肠杆菌。然后将高浓度突变盒片段电转化入含pKD46的Top10F'大肠杆菌中，涂步到含庆大霉素的LB固体培养基，放在30℃培养，最后进行筛选与验证。