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1.2实验方法

基因工程大肠杆菌培养基优化方法多样，以往研究中有一些比较成熟方法，如单因素实验法、正交设计实验法及响应面分析法；当然还有一些不太被应用的，如均匀设计法等。本研究依据文献主要采用单因素实验法，首先确定培养基优化的因素，然后针对不同的因素，即pH、葡萄糖、蔗糖、甘油、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化锰、氯化亚铁、氯化铜、硫酸锌等不同因素设置不同浓度梯度配制发酵培养基，之后再通过菌种保藏，菌种活化，摇瓶培养，酶活测定等步骤进行研究[7-9]。

1.2.1菌种保藏

    配制1000ml的LB液体培养基，分装于4个500ml的锥形瓶中，121℃，20min高压灭菌，留用。将原有的基因工程大肠杆菌接入已经加入10ul卡那的10ml液体培养基中，37℃摇床培养4h，利用分光光度计测定菌液的OD600值，待OD600值涨至0.8-1.0之间，4℃，8000r/min，3min 反复离心三次，去上清后，再加入蒸馏水吹打混匀。取800ul菌液至冷冻管，再加入600ul的50 %的甘油混合后，放置于-20℃的冰箱进行保藏。

1.2.2 菌种活化、传代与接种

    配制LB固体培养基，121℃，20min高压灭菌，冷却后加入卡那霉素，倒入培养皿中配成固体培养基。将保存于-20℃的菌种取出，用涂布分离法将菌种涂布在原先配制好加入卡那的固体LB培养基上，放置在37℃的培养箱中培养24h[10]。

    24h后，挑取单菌落，用划线分离法将菌种接种在固体的LB培养基上，同样放置在37℃的培养箱中培养24h。

1.2.3摇瓶培养

    24h后，将菌种转接至10ml的液体LB液体培养基中，即种子培养基，同时加入10ul的50mg/ml的卡那霉素，混匀后放入摇床，37℃，200r/min，摇床培养12h。

    选取不同的因素，按照不同的浓度梯度配制液体培养基，即发酵培养基，先配置基本的LB培养基，用pH计调节液体培养基的指定的pH，并分装至100ml的锥形瓶中，每瓶25ml，再依据研究的因素分别将不同浓度的成分加入到摇瓶中，灭菌留用。将培养12h后的菌液以千分之二的接种量接种至锥形瓶中，同时加入25ul的卡那霉素，37℃，200r/min，培养4-5个小时。常用控制pH的酸碱有HCl、H3P04、H2SO4、NaOH、KOH等。在本实验中，我们主要使用的是NaOH、HCl、Tris-HCl（pH 8.8，0.5mol/L）调节pH，其中Tris-HCl（pH 8.8，0.5mol/L）是专门用于调节不含Na+的培养基的pH。

    4-5小时后，用分光光度计测定OD600，若OD600的值在0.8-1.0之间即可转接。取5ml菌液转接至试管，然后加入1mM IPTG进行诱导，摇床200r/min，37℃诱导22h后，将菌液置于1.5ml离心管中，4℃，8000r/min，3min反复离心三次，去上清液，加入500ul/管的蒸馏水，吹打混匀后放入-20℃冰箱和37℃培养箱，反复冻融3次。置于-20℃冰箱保存。

1.2.3酶活测定

    本研究中发酵生产的核酸酶是一种非特异性核酸酶。非特异性核酸酶既可作用于RNA，也可作用于DNA，这类酶对底物中的糖没有专一性。因此，非特异性核酸酶在核酸工业中的应用更加广泛，目前非特异性核酸酶在商业上也有所应用。传统非特异性核酸酶活性的检测方法主要有凝胶电泳，放射性标记，荧光分析技术等，本研究中使用的是最为常见的检测方法，即琼脂糖凝胶电泳法[11-13]。

1.2.3.1配制测酶活底物

通常用于核酸酶酶活测定的底物有小牛胸腺DNA，鱼精DNA等，本研究中使用的是小牛胸腺DNA作为酶活测定反应底物。

本研究使用的小牛胸腺DNA，配方如下（100 ng/ul）：

 MgCl2·6H2O  0.4066g； (责任编辑：qin)