外源褪黑素通过调节抗氧化系统和降低镉的吸收来提高小白菜对镉的耐性(3)
时间:2020-05-05 15:00 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.3 测量相关指标 1.3.1 镉含量的测定 分别称取0.1g地上部分和根部干样，于5 ml HNO3的体系中进行微波消解35 min，随后用蒸馏水将溶液定容至25 ml备用。用5 % HNO3配制Cd的标准曲线，使用仪器ICP-MS（Optima 2100 DV,PerkinElmer Waltham,MA,USA）测定镉含量。 1.3.2 叶绿素含量的测定 小白菜幼苗处理10 d后，每组称取0.2 g新鲜叶片剪碎，用95 %乙醇浸提过夜，然后分别测定浸提液在665 nm、649 nm及470 nm处的吸光值，代入公式即可算得光合色素浓度（ug/ml），公式如下[4]： 叶绿素a（Chl a）=13.95 * OD665 - 6.88 * OD649 叶绿素b（Chl b）=24.96 * OD649 - 7.32 * OD665 类胡萝卜素（Car）=（1000 * OD470 - 2.05 * Chl a - 14.8 * Chl b）/ 245 1.3.3超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 1.试剂的配制 （1）0.05 mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2 mol/LNa2HPO4溶液：取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7 g； B母液：0.2 mol/LNaH2PO4溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2 g。 分别用蒸馏水定容至1000 ml。 （2）0.05 mol/L PBS（pH 7.8）：将228.75 ml A母液和21.25 ml B母液混合，用蒸馏水定容至1000 ml。 （3）14.5 mM甲硫氨酸溶液：用PBS将2.164 g Met定容至1000 ml。 （4）30 μM EDTA-Na2溶液：用PBS将0.001 g EDTA-Na2定容至100 ml。 （5）60 μM核黄素溶液：用PBS将0.0023 g核黄素定容至100 ml（保存需避光）。 （6）2.25 mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：用PBS将 0.184 g NBT定容至100 ml（保存需避光）。 2.酶液制备：取1.6 ml PBS并与研钵一起预冷，再取0.2 g洗净的样品加入其中研磨均匀，4℃下12000 g离心20 min，上清液即为酶液。 3、酶活性测定 （1）反应混合液配制：将5.4 ml PBS，162 ml甲硫氨酸溶液，0.6 ml EDTA-Na2溶液，6 ml核黄素溶液，6 ml氮蓝四唑溶液混合并摇匀； （2）分别取100 μl酶液和3 ml反应混合液于试管中； （3）使用光照培养箱，让试管在4000 lux的环境下反应20 min；（要选择相同规格的试管，保证试管透光率相同，这个最好分组做，一组一个重复，一组完就做好所有的处理，且都要有一个最大管放在中间） 同时配置一份只有缓冲液的试管置于暗中，作为调零对照管。 （4）以不照光的对照管调零后，测定OD560(在无光环境下出现颜色即可)。 （5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50 ％所需的酶量为1个酶活单位（u）。 SOD总活性＝ [ ( ACon-AE ) × V] /（1/2 ACon × W × Vt）(u/g FW)[5] SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量 SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；SOD比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACon为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量；W为样品鲜重（mg）；蛋白质含量单位为mg / g。 1.3.4过氧化物酶（POD）活性测定 1、试剂配制： （1）0.2 mol/L PBS(pH 6.0)：将123 ml A母液和877 ml B母液定容至1000 ml。 （2）反应混合液配制：取200 ml PBS(0.2 M，pH 6.0)，加入0.076 ml液体（原液）2-甲氧基酚加热搅拌溶解，待溶液冷却，加入0.112ml 浓度为30 ％的H2O2，混合均匀。 2、样品测定：将100 μl酶液加入3 ml反应液中，用磷酸缓冲液调零，测定OD470值，40s后重新测定。 3、酶活性计算：以每分钟OD值升高0.01为1个酶活性单位（u）。 POD=（ΔA470 × Vt）/（W × Vs × 0.01 × t）(u/g min)[5] ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时取用酶液体积。 (责任编辑：qin) |