TOR对于灵芝生长及灵芝酸合成的影响(2)
时间:2020-05-05 15:05 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
雷帕霉素的靶蛋白（TOR）最初是通过突变体TOR1-1和TOR2-1鉴定的，其突变功能是在酿酒酵母中产生对雷帕霉素的生长抑制性质的抗性[ ]。这项研究还表明，雷帕霉素需要胞内辅因子peptidyl-prolylcis /反式异构酶FKBP12来产生毒性。雷帕霉素与FKBP12形成复合物，然后该复合物结合并抑制TOR。 随后有学者在哺乳动物细胞中的生物化学研究中设计制作了雷帕霉素的靶标mTOR（也称为FRAP，RAFT，RAPT或SEP[ ][ ]）的鉴定和克隆。到目前为止，已在多种真核细胞基因（包括酵母，藻类，粘菌，植物，蠕虫，苍蝇和哺乳动物）中都发现TOR基因。与酵母不同（酵母在一些情况下具有两个TOR基因），高等真核生物仅具有单个TOR基因[ ][ ][ ]。 TOR在生物体中是不可或缺的一个功能性蛋白，具有多种重要的生理作用：如作为细胞生长的中央控制器，控制细胞生长的时间与空间；调节后生动物的早期生长，控制细胞的增值与分化；以及在人体中TOR可以调节成人的记忆与衰老，这可能与TOR是控制细胞自噬的关键因子有关。我们根据TOR复合物中所含基团的不同把TOR复合物分为两种，第一种是包含TOR1和TOR2基团的TOR复合物1（TORC1），第二种是只包含TOR2的TOR复合物2(TORC2)，两种复合物具有不同的特性与功能，其中TORC1对雷帕霉素敏感并调节细胞的生长时间与周期；而TORC2对雷帕霉素不敏感，并调节细胞的空间生长[ ]。且有研究表明[11]，TOR与人体肿瘤、自身免疫病以及心血管疾病等人类恶性疾病有关，因TOR具有如此重要的功能，现在各国都把TOR作为细胞亚显微结构研究的重点对象。 因TOR具有如此重要的功能，并且存在于大多数真核生物细胞中，然而在灵芝细胞中的TOR对灵芝的生长及灵芝酸合成产生重要影响尚未有研究进行阐述。我们通过对灵芝中tor基因进行沉默，测量沉默株表型与野生型表型之间的差别来研究TOR对灵芝的影响。我们发现TOR对于灵芝生长及灵芝酸合成具有重要的作用。当TOR被沉默之后，灵芝生长受到抑制，并且灵芝酸合成收到影响。我们进一步研究发现ROS在TOR沉默影响灵芝生长和灵芝酸合成中发挥信使功能： ROS在正常培养时，ROS浓度与TOR成负反馈调节，并且TOR有可能通过ROS来调节灵芝生长与灵芝酸合成。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌种 供试菌株G20菌株及其导入pmi空质粒与TOR沉默菌株（现保存于南京农业大学生命科学学院微生物实验室）。 1.1.2 培养基 CYM培养基： 10%麦芽糖、20%葡萄糖、0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、0.05%七水硫酸镁、0.46%磷酸二氢钾加去离子水溶解，pH调至7，每100 mL分装后115℃灭菌30min（如需调制固体培养基，将每100mL液体培养基加入1.5g琼脂糖分装）。 PDA培养基： 去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、定容1L，pH自然，每100mL分装后115℃灭菌30min（如需调制固体培养基，将每100 mL液体培养基加入1.5g琼脂糖分装）。 1.1.3 试剂与溶液 试剂：雷帕霉素溶液（RAPA 0.0125 μg/mL）、ROS染液（原液稀释1000倍使用）、荧光增白剂（粉末溶解至1mg/mL）、冰醋酸、95%乙醇、高氯酸等。 溶液：香草醛（将5 g香兰素溶解于100 mL冰醋酸）。 1.1.4 主要仪器设备 分析天平、种子破碎机、摇床、高压蒸汽灭菌锅、分光光度计、荧光显微镜、超声波清洗仪、研钵、恒温水浴锅、烘箱、超净工作台等。 1.2 实验方法 1.2.1 灵芝培养 （1）平板培养：取灵芝母种WT、CK1、CK2、T-1、T-8、T-12并接种于CYM平板培养基中央，于28℃恒温培养至菌丝长满平板，其留作观察菌落生长、菌丝分叉以及ROS含量检测使用（WT+RAPA处理每100 mL CYM固体加入10 ul 0.125mg/mL RAPA抗生素）。 (责任编辑：qin) |