TOR对于灵芝生长及灵芝酸合成的影响(3)
时间:2020-05-05 15:05 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
(2)液体发酵培养:将WT、CK1、CK2、T-1、T-8、T-12灵芝液体发酵种子接种于装有100 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中,放入150 r/min,28 ℃摇床培养4~5天,将灵芝菌丝球培养至生长对数期。小型种子打碎机将摇瓶培养的液体种子匀浆打碎,将100 mL CYM培养液装入250 mL摇瓶,每瓶接种匀浆5 mL。放入150 r/min,28 ℃摇床培养11天(WT+RAPA处理每100 mL CYM液体加入10 μL 0.125mg/ mL RAPA抗生素)。 1.2.2 菌丝生长情况测定 选取野生型WT、对照CK1、CK2、沉默株T-1、T-8、T-12六种长势较好菌株活化平板,并用Ф=6 mm的无菌打孔器进行打孔,将菌块接种至CYM平板上(雷帕霉素处理的野生型WT+RAPA接种的平板提前雷帕霉素处理),放入28 ℃温箱培养5天,取出观察菌丝生长形态,并记录菌落直径。 1.2.3 灵芝酸含量的测定 1) 用分析天平,精密称取烘干的样品(WT、CK1、CK2、T-1、T-8、T-12、WT+RAPA)0.2 g,用95% 乙醇浸泡样品,并定容至10 mL,超声破碎两小时,每20 min摇动一次,取1.5 mL 4000 r/min离心10 min,取400 μL上清液备用。 2)参比配置:准确吸取0.1 mL 95%乙醇于10 mL具塞试管,并进行3个重复。 3)精确提取0.10 mL上清加入10 mL具塞试管中,依次加入0.20 mL香草醛,0.50 mL高氯酸,混匀,盖盖,每种样品重复三次,60 ℃水浴20 min,取出后立即冷却10 min,然后加入冰醋酸5.00 mL,用试管振荡器混匀后于550 nm处测定吸光度。 1.2.4 菌丝分叉检测 在已经接种有菌块的平板培养基上斜插已经灭菌的盖玻片,放置于28℃恒温培养箱进行培养,等菌丝生长爬上盖玻片后将盖玻片取下,用2.5 μg/mL 的荧光增白剂进行染色后,利用荧光显微镜进行观察,并统计每个处理的菌丝分叉间距。 1.2.5 DCFH-DA染色法测定胞内ROS浓度 将生长在固体培养基上插片的菌丝培养4-7天取出盖玻片进行H2O2的荧光检测。采用DHCF-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)荧光探针结合荧光显微镜(Zeiss Axio Imager. A1 Fluorescence Microscope)进行观察。将长有菌丝的盖玻片28℃孵育与10μmol DCHF-DA持续15分钟,用10mML磷酸钠缓冲液(pH=7.5)洗涤2-3次去除残余染液后置于激光共聚焦显微镜下观察。 (责任编辑:qin) |