亚精胺对淹水胁迫下玉米幼苗根系抗氧化代谢调控(3)
时间:2017-04-23 16:24 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
FW： 样品鲜重（g）； 0.1：OD240 每下降 0.1 为 1 个酶活力单位（U） ； T：加过氧化氢到最后一次读数的时间（min）。 1.4超氧化物岐化酶（SOD）活性的测定 按刘萍、李明军的比色法测定SOD活性[9]。具体方法： 1.4.1酶液的制备: 称取玉米根部0.5g剪碎，置于研钵（预冷）中，加入5mL预冷的 50mmol/L（pH7.8）磷酸缓冲溶液（分多次加入），在冰浴下研磨成匀浆后，置于3000r/min离心10min（2~4℃）。上清液即为酶的粗提取液，测量其总体积并记录。 1.4.2酶活力的测定： 取3支试管，编号，依次按表2加入试剂。用黑纸包上2号管，比色时作空白，与其他两管一起放在荧光灯（光强60umol/m2 •s）下，照光10min，然后把试管均罩上黑布，测定待测样品和无酶反应液在560nm处的吸光度值。 表2 各溶液加入量 试剂 试管1 试管2 试管3 反应介质/ml 3.9 3.9 3.9 酶提取液/ ml 0.1 0.1 0 磷酸缓冲液/ ml 0 0 0.1 备注 待测样品 空白 无酶反应液（对照） 1.4.3计算SOD的活力： SOD总活力=（A0-As）×VT/（A0×0.5FW×V1） 式中SOD总活力以每克鲜重酶单位表示； A0为照光对照管的吸光度值； AS为样品管的吸光度值； V1为测定时样品的用量（ml）； VT为样液的总体积（ml）； FW为样品鲜重（g）； 1.5过氧化物酶（POD）活性的测定 按刘萍和李明军的分光光度法测定POD活性[10]。具体方法： 1.5.1酶液的制备: 称取玉米根部0.5g剪碎，置于研钵（预冷）中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，将匀浆液全部倒入离心管中，以3000r/min离心10min，上清液倒入25mL容量瓶中，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。 1.5.2酶活力的测定 （1）取两只试管，均加入0.05mol/L磷酸缓冲液2.9mL，2%H2O21mL和0.05mol/L愈创木酚1mL，然后在其中一支试管中加入0.1mL酶液，在另一只试管中加入0.1mL在沸水中加热煮沸5min的酶液（作对照）。立即于37℃水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸2mL终止反应。 （2）以5000r/min离心10min，收集上清溶液并适当稀释。 （3）用722型分光光度计，在470nm下测定2支试管中反应液的吸光度值。 1.5.3计算结果 以每分钟吸光度之变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，计算过氧化物酶的活力与比活力。 酶活力（0.01△A/min）=△A/0.01t×D 酶的比活力[0.01△A/(g/min)]=△A/（0.01t×W）×D 式中△A为反应时间内吸光度值的变化； t为反应时间（min）； D为稀释的倍数，即提取总酶液为反应液内酶液的倍数； W为样品的鲜重（g）； 1.6抗坏血酸氧酶（APX）活性的测定 按刘萍、李明军的比色法测定APX活性[11]。具体方法如下： 1.6.1 酶液的提取 取植物材料2g，剪碎置于研钵中，加少量石英砂及PH6.0的磷酸缓冲液，在低温下迅速研磨成匀浆。把匀浆液用缓冲液冲洗入50mL容量瓶中，并用PH6.0的磷酸缓冲液定容到刻度。放在18℃~25℃水浴上浸提30min，中间摇动数次，将上清液倒入洁净的三角瓶中备用。 (责任编辑：qin) |