几种高温DNA聚合酶性质比较+文献综述(3)
时间:2017-04-26 22:57 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
（3）延伸，耐热性DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生的DNA链延长。常在热稳定DNA聚合酶的催化活性、DNA合成的最适温度下进行。Taq DNA聚合酶最适温度一般为72~78℃，在这一温度范围内，Taq DNA聚合酶的聚合速率约为2000bp/min[20]。 （4）循环数目。反应体系中起始的模板DNA拷贝数、引物延伸速率和DNA聚合酶的扩增的效率等都会影响PCR扩增所需的循环数目。随着反应循环次数的增加，特定DNA片段便呈指数形式增加，即以2n方式扩增(n为反应周期数)。从理论上讲经过30个循环，特定DNA片段的数量可增加109，对于Taq DNA聚合酶，在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30次循环后就可以达到上述情况了。 1.1.3 PCR扩增的实验条件 PCR的基本反应体系包括：模板（template）、寡核昔酸引物（primers）、反应缓冲液（reaction buffer system）、一价或二价阳离子（monovalent or palent cations）、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTP）、DNA聚合酶以及PCR促进剂[21]。 特异性、忠实性和高效性是检验PCR反应效率的三个重要指标。PCR的高特异性是指PCR反应只产生需要的靶序列，高效性是指经过相对较少的PCR循环便能获得较多的目的产物，忠实性是指PCR 的精确性和保真性，且其产物几乎没有碱基错配现象。 理想的PCR反应该是高度特异性、高效性和忠实性的综合表现。研究表明这三个指标中的每一个都会受PCR反应的体系成分及反应条件的影响，包括缓冲液条件、温度控制、每一步的持续时间以及DNA聚合酶的活性等[22]。因此，在进行PCR反应前，可根据各个试验参数的重要性来优化PCR反应条件。 1.2常见几种高温DNA聚合酶 我们最熟知的耐热 DNA 聚合酶应用在 PCR 技术中。各种耐热DNA 聚合酶均具有5′-3′聚合酶活性, 但在5′-3′外切酶活性和3′-5′外切酶活性上存在一定的差异[23]。外切5′-3′酶活性可以消除DNA 合成中的障碍; 3′-5′切酶活性可以将产物的末端切平,同时还可以删除DNA 合成中错配的核苷酸, 称为“校对” [24]。由于它们酶活性上的不同,因而在产物的特性、忠实性、酶的用途上存在一定差异。 1．2.1 Taq DNA 聚合酶 该酶是1969 年从美国黄石国家森林公园火山温泉中一种水生栖热菌( T hermus aquaticus) yT1 株分离提取的,是发现的耐热 DNA聚合酶中活性最高的一种, 达200,000单位/ mg[25]。它具有5′-3′外切酶活性,但不具有3′-5′外切酶活性,因而在DNA 合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。 Taq DNA聚合酶还具有非模板依赖性活性, 可将PCR双链产物的每一条链3′端加入单核苷酸尾,故可使PCR 产物具有3′突出的单A 核苷酸尾;另一方面, 在仅有dTTP 存在时,它可将平端的质粒的3′端加入单T 核苷酸尾,产生3′端突出的单T 核苷酸尾的质粒。应用这一特性可实现PCR 产物的T - A 克隆法[26]。 1．2 .2 Pfu DNA 聚合酶 是从Pyrococcus furiosis 中精制而成的高保真耐高温DNA 聚合酶, 它不具有5′-3′外切酶活性, 但具有3′-5′外切酶活性,因而可纠正 PCR 扩增过程中产生的错误,使产物的碱基错配率极低。PCR 产物为3′平端, 无端突出的单核苷酸。 1. 3 DNA聚合酶研究现状及意义 1.3.1 Taq DNA聚合酶的发现 Taq DNA Polymerase是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶。1998年Rand II K.Saiki[27]等从Thermus aquaticus中分离获得了Taq DNA Polymerase，并将其成功的应用于PCR的扩增中，提高了反应的敏感性和特异性，是PCR技术走向实用化的一次突破性进展。 1.3.2耐热Taq DNA聚合酶的结构及功能特性 (责任编辑：qin) |