pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对lux box启动的影响(3)
时间:2016-12-03 11:26 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
图1-1 pPopctrl质粒结构示意图 Fig.1-1 Structure of plasmid pPopctrl. 试验中pLuxRI2 在IPTG的诱导下，将会表达产生LuxI和LuxR。当试管或培养皿中细胞密度达一定阈值时，pluxCcdB3将应答活化的LuxR蛋白，最终会导致细胞死亡。由lacZa-ccdB死亡基因编码LacZa和CcdB的融合蛋白。融合蛋白的LacZa部分在适当的宿主中（如Top10F'）保持了与LacZDM15的互补性，从而可以利用蓝白斑进行互补筛选以鉴别构建正确的质粒，而CcdB表达则可以使细胞由于中毒而死亡。 上述构建的LuxR-LuxI系统，其启动细菌自杀的作用机制示意图见图1-2。 图1-2细菌自杀的作用机制示意图 Fig.1-2 Sensing mechanism of QS 已有研究发现，当人体细胞中的基因发生了对自己不利的变异后，人体内负责参与和调节物质代谢的蛋白酶便会促使细胞与一种氧化剂——羟基自由基（-OH）结合。在这一过程中，羟基自由基（-OH）会破环细胞内的物质，使细胞死亡，而与该细胞相邻、具有正常基因的细胞却不会受到任何影响。已有用线虫作为实验目标，找到了研究受精卵如何分裂分化成人的可能性。发现了控制器官发育和“程序性细胞死亡”的关键基因，证实了在包括人类在内的较高级物种中也存在着相应的基因。这些研究证明了基因控制细胞自杀行为的存在，及自杀行为和一般正常死亡的区别。 1.3. LuxR蛋白基本结构特点 LuxR蛋白有250个氨基酸组成。它分为两部分，N端和C端。N端部份占R蛋白大部分比例（1~156）。其主要功能是，结合细胞间的信号物质，调控C端的活性。C端部分（157~250），是R蛋白与DNA的结合区域。这一部分的突变，能够影响R蛋白的活性，直接决定了是否能够激活LuxBox启动子，从而使细胞处于群体感应的状态。 1.4. 抗自杀突变种群 立足于细菌的群体感应原则，构建含有自杀基因回路的质粒。有自杀基因回路的质粒控制的细菌在其自杀过程中，少数细菌会因为发生基因突变而逃脱死亡机制的控制，最终成为优势种群即抗自杀的突变种群。如此推理下去，自然界中存在的逃脱死亡控制的突变株理应淘汰掉野生型菌株，野生型因为自杀应该在自然界中消失。也就是说最后自然界将只存在突变株，自杀行为将不会出现。但由目前国内外研究所得的事实是，抗自杀的突变株并没有在自然界占据统治地位，自杀行为一直在自然界长期存在。 1.5. 本研究主要内容及其意义 我们知道，自然界中的细菌，为了保证其族群的稳定性，在种群内部存在着一种调节机制：当面对外界出现的一些选择压力时，比如环境变化、营养变化、温度变化等，大量的细菌会自发地接连死去，只剩一小部分“幸存者”，以此来保全其种族的稳定繁衍。在这个过程中，会有一部分“幸存者”发生突变，这种变异，令他们能够逃过选择压力，在同族大批死亡之际，依然生存下来，并保持着迅猛的繁殖速度。结果是，其在种群中的比例持续走高，大有取而代之之势。但是，这种“逃避”是暂时的。通过前人的反复观察，已然发现，这种数量上的上升并非一成不变。在未来的某一时刻，其比例会发生下落，而且异常迅猛。这是为什么呢？既然已取得生存优势、数量优势、种群优势，一夜之间销声匿迹，让位于一度濒于灭绝的野生型细菌，这一切似乎不符合逻辑。有人理解为这是一种惩罚，类似于末日审判，也有人认识其为一种偿还，对先前所得利益的一种反馈。不管怎么讲，这都是一些猜想，没人验证过。本实验的主要任务，就是从分子生物学角度去解释这个问题，即提出我们的猜想：在贫营养环境下，突变型细菌产生的R蛋白较之于野生型细菌产生的R蛋白更容易激活LuxBox启动子，产生更多的Ccd B蛋白，令突变型细菌大量死亡。并且通过实验证明之。同时，通过实验，证明Tn5转座子能够赋予突变的R蛋白连接LuxBox的能力，从而得出结论，突变的R蛋白中，Tn5转座子代替正常R蛋白中C端的功能。 (责任编辑：qin) |