木霉1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（ACCD）的分离纯化及功能(3)
时间:2017-05-07 11:06 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
1.5 大豆生长指标的测定 大豆所测的生长指标包括株高、茎粗、干重和湿重。株高与茎粗采用细线与直尺相配合的方法进行测量。利用水遇热为水蒸气的原理，可用加热烘干法来测定植物组织的干重与湿重。 1.5.1 大豆株高、茎粗的测量 1.5.1.1 操作步骤 每盘轻拔出若干大豆幼苗，分别用细线量出大豆株高的长度，并在细线上做好标记，然后用直尺测出所做标记的细线长度，并得出每盘大豆的平均株高。把每盘所取的若干大豆横切，排成一排，测其直径总和，再计算出每株大豆的茎粗。 1.5.2 大豆干重、湿重的测定 1.5.2.1 操作步骤 （1）称量瓶的恒重：将洗净的8个称量瓶编号，放在105℃恒温烘箱中，烘两个小时左右，用坩埚钳取出放入干燥箱中冷却至室温后，在天平上称重。再于烘箱中烘两个小时，同样于干燥箱中冷却称重，如此重复两次（两次称重的误差不得超过0.002g），求得平均值为W1。 （2）将待测大豆真叶从植株上取下后迅速剪成小块，装入已知重量的称量瓶中盖好。在分析天平上准确称取重量，得瓶与鲜样品总量为W2，然后于105℃烘箱中干燥4～6小时（注意要打开称量瓶盖子）。取出称量瓶，待其温度降至60～70℃后，用坩埚钳将称量瓶盖上，放在干燥器中冷却至室温，再用分析天平称重，这样重复几次，直至恒重为止。称得重量是瓶与干样品总重量为W3。 1.5.2.2 结果计算 样品湿重（鲜重）：Wf =W2－W1 样品干重：Wd=W3－W1 1.6 大豆生理指标的测定 所测大豆的生理指标有POD、SOD、CAT活性。POD活性测定采用愈创木酚法[6]，SOD活性测定采用连苯三酚自氧化法[7]，CAT活性测定采用紫外分光光度测量法[8]。 1.6.1 POD活性的测定 1.6.1.1 实验试剂 0.02mol/L KH2PO4溶液，0.1mol/L、pH6.0磷酸缓冲液，反应混合液：取0.1mol/L、pH6.0磷酸缓冲液50mL，加入愈创木酚8mL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢9mL，混合均匀，于冰箱中保存。 1.6.1.2 操作步骤 （1）粗酶液的制备：20μL孢子悬浮液接种到10ml SM培养基中培养48小时。得到的菌丝冲洗后接入到SM无铵培养基中，分别加入0.0005g/ml、0.001g/ml、0.0015g/ml、0.002g/ml、0.0025g/ml、0.003g/ml的ACC，诱导培养的最后阶段。培养物重悬于1/2体积的Tris缓冲液中（0.1M PH=8.5），并匀浆。 （2）大豆样品过氧化物酶活力的测定：取出比色杯，已知加入混合液3mL和0.02mol/L KH2PO4溶液1mL，作为调零空白；另一只加入反应混合液3mL和上述粗酶液1mL，立即开启秒表计时，于分光光度计470nm处比色测定吸光度，每隔30s读数一次。 1.6.1.3 结果计算 以每分钟内OD470变化0.001g/ml为1个过氧化物酶活力单位（1U），计算大豆材料过氧化物酶的活力。 POD活力（U/g，FW/min）)= （∆OD470×VT）/（0.001g/ml×W×VS×t） 式中：OD470：反应时间内吸光度的变化；W：大豆材料的鲜重（g）；t：反应时间（min）；VT：提取液的总体积（mL）；VS：测定时取用酶液体积（mL）。 1.6.2 SOD活性的测定 (责任编辑：qin) |