毕业论文移动版

1.1.1. 谷氨酸脱氢酶的一般性质

参考已有的对谷氨酸脱氢酶的研究，谷氨酸脱氢酶的最适反应温度为40℃，常温下保存易失活，在4℃下能保存较长时间，同时甘油对延长其保存有明显效果。在酸性条件下，谷氨酸脱氢酶易失活，在碱性条件下，pH5—9时，谷氨酸脱氢酶很稳定，大于9时，稳定性下降，总的来说谷氨酸脱氢酶的构象在碱性条件下比较稳定[4]。一些常见金属离子对酶活的影响如下：Zn+、Cu+可以显著抑制谷氨酸脱氢酶的活性，Li+、Fe2+、Mg2+也对谷氨酸脱氢酶有不同程度的抑制，其它离子对酶活力的影响不明显[5]。在催化α-酮戊二酸和氨基生成谷氨酸时，谷氨酸脱氢酶的最适pH为8.5左右，而它的逆反应，即由谷氨酸脱氨基时，最适pH为10左右。

1.1.2. 谷氨酸脱氢酶的用处

谷氨酸脱氢酶常见于制备尿素氮试剂盒（速率法），此外，由于谷氨酸脱氢酶的辅酶为NADH或NADPH[15]，因此，可以用于NADH、NADPH的再生。在人体内，谷氨酸脱氢酶主要存在于肝线粒体中，所以血液中谷氨酸脱氢酶这一指标可以作为肝损伤的检测指标，具有很大的使用价值。

1.1.3. 酶活的测定方法

酶活的测定是依据GDH能催化α-酮戊二酸和氨基生成谷氨酸,同时NADH被氧化为NAD+，利用NADH在340nm处有较大吸光值，通过检测样品吸光值的减少，来测定酶活的高低，定义为：每分钟催化1umol NADH氧化为NAD+的酶的量为一个酶活力单位。反应体系中各物质的浓度依次为：1ml 0.08mol/L pH8.5的Tris-Hcl缓冲液，200ul 2.80mol/L的NH4Cl溶液，200ul 0.135mol/L pH8.5的α-酮戊二酸，20ul 2.819mmol/L的NADH。

1.2. 谷氨酸脱氢酶的研究意义和研究现状

1.3. 研究工作的主要内容

本课题主要对有效提取双孢菇和鸭肝中的谷氨酸脱氢酶进行了尝试。

对于组织粗提物先后比较了重金属离子沉淀法、硫酸铵沉淀法、聚乙二醇——硫酸铵沉淀法等处理方法，待制得粗酶液后，再分别用超滤、硫酸铵沉淀方法处理，最后在上柱时，分别比较了单纯酶液上柱、聚乙二醇作为保护剂上柱、甘油作为保护剂上柱，直至取得较好的酶活。参照之前在提取鸭肝谷氨酸脱氢酶上所做的工作，面临的主要困扰是粗酶液的制备和酶活的保持。对于粗酶液，由于鸭肝里面所含的物质太多，所以采用常规的蛋白质提取办法，无法得到澄清而又具有较高酶活的粗酶液。而且谷氨酸脱氢酶由多个亚基组成，在提取过程中又极易失活，所以本课题的主要研究方向是探索出一种简单可行而且总酶活提取率还相对比较高的粗酶液制备方法，另外对于在提取过程中酶易失活的问题也尝试采取适当的保护措施，尽最大的可能保持酶活。以上两方面就是本课题的主要工作内容。文献综述

1.4. 常见的从动植物组织中提取粗酶液的方法介绍

1.4.1. 组织破碎方法

对于植物，由于组织构成比较简单，可以简单的将对应的组织用去离子水洗干净，然后就可以进行破碎，一般就可以取得较好的效果。

对于动物组织，比如本课题实验中所用的材料鸭肝，因为已知谷氨酸脱氢酶在线粒体中，所以在破碎前可以先用剪刀把脂肪和结缔组织去掉，并把鸭肝剪成碎片，再用去离子水洗净其中的血丝，这样就可以为后续的提纯步骤避免很多不必要的麻烦。

关于组织破碎方法，常见的有高速珠磨法、匀浆法、超声波法、冻融法。对于前三种方法，在破碎时易生成大量的热，所以采用这些方法破碎时要注意低温，解决办法之一是把组织液放在冰浴中破碎。另外超声破碎时会产生化学自由基，易使一些生物活性物质失活[8]。对于冻融法就是要控制好冻融的次数，因为蛋白质在反复冻融之后结构也容易被破坏。 (责任编辑：qin)