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荧光标记目前已经被广泛的运用在研究活体细胞内的蛋白质动力学研究中， 可以研究特定蛋白的在细胞内的扩散过程和运输过程，当被GFP标记的蛋白质在细胞内运动时通过荧光显微镜或共聚焦显微镜对这一动态过程可以进行直接成像观察，对这一运动过程的检测观察，我们可以对蛋白质的活化、运输通道途径进行研究。

在本实验中我们通过在FT基因的下游融合GFP蛋白，然后通过CAMV 35S启动子对FT融合蛋白在本氏烟叶片中进行表达，之后结合共聚焦显微镜对FT突变体在细胞中的运输途径及胞内定位进行了观察研究。

一、 材料与方法

1. 植物材料及生长条件

野生型本氏烟（Nicotiana benthamiana）为本实验室保存，植物均生长在25℃恒温室中，光照条件为16 h光照/8 h黑暗。

2. 质粒材料

实验中使用的pEAQ-HT-GFP，pEAQ-HT-mFT-GFP由杭州师范大学植物RNA信号传导中心主任洪益国教授提供。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404，用于农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达，由本实验室保存。文献综述

构建完毕得到的两种mFT突变体的质粒分别为pEAQ-HT：：mFT-V70A：：GFP 和pEAQ-HT：：mFT- V85A：：GFP，插入在含有卡那抗性的pEAQ-HT-GFP质粒中，如图1 所示。

 pEAQ-HT：：mFT：：GFP的质粒图示

3. 试剂材料

质粒小提Qiaprep Spin Miniprep Kit，购自Qiagen；卡那霉素(Kanamycin,Km)购自上海生物工程有限公司

4. 基本培养基配方

YEB培养基（培养农杆菌用）

Trptone         1 %（W/V

Yeast extract     0.1 %（W/V）

MgSO4·7H2O  0.5 g/L 

蔗糖           0.5 %（W/V） 

pH 7.0

(固体培养基加1.5%的琼脂)

二、 实验方法

1. mFT-GFP质粒的转化

本实验中对实验室提供的已经构建完毕的两种含有FT突变体的瞬时表达载体pEAQ-HT：：mFT-V70A：：GFP 和pEAQ-HT：：mFT- V85A：：GFP进行了质粒转化，获得含有相应质粒的大肠杆菌

热击转化法

1) 从-81 ℃的冰箱中取出分装好的感受态细胞置于冰上，待其缓慢冷却后取出连接产物10 µl或重组质粒0.5 , 加入到50体系中，冰浴30 min；

2) 然后金属浴42 ℃，热击1 min（为了让连接物能更有效进入到感受态细胞内），置于冰上5 min；

3) 加入置于金属浴中42 ℃带有无抗性的LB培养基；

4) 置于37 ℃的摇床约1 h；

5) 4000 rpm离心5 min；

6) 在提前紫外消毒过的超净工作台中，将已离心过的LB培养基去掉上液，留下约100 的底部沉淀，进行反复吹打，涂布在含有相应抗性的LB培养基上，用封口膜进行封口；

7) 37 ℃的培养箱中倒置培养过夜，24 h后取出。来,自|优;尔`论^文/网www.youerw.com

8) 将长出的菌用移液枪的枪头吸取到新的液体培养基中进行培养。

2. mFT-GFP质粒抽提

通过大肠杆菌的大量培养，我们希望通过质粒抽提来获得大量的目的质粒，因此我们选择了高效快捷的试剂盒的提取法 (责任编辑：qin)