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2 材料与方法

2。1 试验鱼种

    本项试验采用鲫鱼(Carassius auratus)购自当地渔场，平均年龄6-12 月，体重200-300g，行动活泼、鱼鳍完整舒展，健康。 

2。2 试剂和毒素

    全氟辛酸PFOA、全氟十二酸PFDoA、全氟十四酸PFTeDA  均购买自美国Sigma-Aldrich公司。其他所用试剂以及试剂盒购自南京建成生物研究所。

2。3 淋巴细胞分离与诱导

    在无菌室取出健康洁净的鲫鱼头肾，置于预冷的PBS 缓冲液中用眼科剪剪碎，过200 目不锈钢细胞网筛，应用淋巴细胞分离液，5000rpm 离心30min 分离得淋巴细胞，收集的细胞用PBS 缓冲液洗3 次后置于RPMI1640 培养液（含10%新生胎牛血清）中培养，细胞培养箱的温度维持在27℃。为排除单核细胞等干扰，在27℃培养2-3h 后收集上清液，1500rpm 离心10min，细胞加新鲜培养基（含10%新生胎牛血清，100μg/ml 青霉素和100μg/ml 链霉素）重悬，待用。细胞密度控制在106 cell/ml。

2。4流式细胞仪检测细胞内ROS变化规律

    对对照组和处理组的淋巴细胞进行离心收集（3000rpm，5min），之后将其重悬于预冷的PBS中，再加入DCFH-DA 直至终浓度为10μM后，在室温下避光孵育20min。上机前用40μm细胞网筛过滤后，用流式细胞仪Incyte 模块检测相应荧光强度变化，通过荧光强度的变化来显示细胞内ROS 的变化规律。检测激发波长为488nm，发射波长为525nm。