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1。1。3 β-葡萄糖苷酶

   β -葡萄糖苷酶(β-glucosidase)又称β-D-葡萄糖苷水解酶，又名纤维二糖酶、龙胆二糖酶和苦杏仁苷酶。是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶[16]。β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分成三类：第一类是能水解烃基β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物，第三类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等[17]。β-葡萄糖苷酶在纤维素的酶水解过程中的作用是催化纤维素二糖转化成葡萄糖。在一定的范围内，糖化率随着β-葡萄糖普酶活力单位的增加而增加，当β-葡萄糖苷酶活力单位增加到一定程度以后，糖化程度就基本趋于恒定；当β-葡萄糖苷酶的活力在纤维素酶中缺乏时，水解产物中就会有大量纤维素二糖积累，这不仅降低了还原糖得率，而且纤维素二糖的存在还会对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶产生很强的抑制作用[18]。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶酶系中重要的酶组分之一，在纤维素的酶解过程中，纤维素二糖转化成葡萄糖必需由β-葡萄糖苷酶催化完成。β-葡萄糖苷酶活力的高低直接影响到纤维素酶系的整体水解速度以及纤维素的水解程度。AAA

2 材料与方法

2。1 实验材料

2。1。1 菌株与质粒

   里氏木霉菌Rut C-30、大肠杆菌DH5α（E。 coli DH5α ），pCAMBIA1300二元质粒(Kanr、Hygr )均由淮阴师范学院生命科学院研究室保存。

2。1。2 培养基

   马铃薯培养基（PDA）用于里氏木霉菌种保存及培养，LB培养基用于培养大肠杆菌。

2。1。3 试剂

   XbaI、HindIII、T4 DNA Ligase、Taq DNA Polymerase、各种DNA Marker、RNase酶、PrimeSTAR Max酶均购于宝生物工程(大连)有限公司（TaKaRa），dNTPs购于北京佳兰生物科技有限公司，PCR引物由赛百盛基因技术有限公司合成，exDNA导纳凝胶回收试剂盒购自淮安百慧公司，分子生物学试剂购自TaKaRa，北京索莱宝科技有限公司等。

2。2 方法

2。2。1 克隆路线

   设计扩增β-act的启动子和cel3a的引物，PCR分别扩增β-act的启动子和cel3a,利用overlapping PCR 将两者连成一个片段得到Pact-cel3a，Pact-cel3a将连接到pCAMBIA1300二元质粒里,用酶切和测序的方法确定cel3a克隆是否成功