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本项目以杭州西溪湿地生态系统为研究对象，采集杭州西溪湿地底泥样品，采用传统培养方式从中分离培养环境微生物，研究系统中可培养细菌的多样性。上述工作的开展，将有助于我们打开湿地这一复杂生态系统“黑匣子”，了解微生物在湿地生态系统中发挥的重要作用，进而为保护湿地生态系统以及污染环境的原位修复提供科学依据。

1。材料与方法

1。1样品采集

    沉积物样品于2014 年6 月采自杭州西溪国家湿地公园保护区。选择了湿地内6种典型的生境: (1) 挺水植物区(蒲苇，白茅等)；(2) 浮水植物区(睡莲，凤眼莲等)；(3) 沉水植物区 (金鱼藻，狐尾藻等)；(4) 湿生植物区 (美人蕉，黄菖蒲等)；(5)水面开阔的河道（岸边有杂草树木丛生）；(6)赤眼鳟野生养殖塘（水草、杂草丛生）。采集上述6类生境的表层(0-10cm)沉积物，每个样品由采样点中心及周围共5个点的土样混合而成。样品编为1-6号。样品采集完成后迅速放入无菌保鲜袋，-20℃保存。文献综述

1。2主要试剂及仪器设备

试剂：细菌蛋白胨，蛋白胨，酸水解酪蛋白，引物、琼脂和琼脂糖，NaCl等常规药品及试剂（国产分析纯），Taq DNA 聚合酶、DNA Marker，细菌基因组DNA快速抽提试剂盒。以上试剂药品均采购自上海生工生物工程有限公司。

仪器：722型分光光度计（上海江仪仪器有限公司）；WH861 型漩涡振荡器（江苏太仓华利达实验室设备公司）；超净工作台（SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台）；Zealway GI54DS 型高压蒸汽灭菌锅（厦门致微仪器有限公司）；FPG 系列多段可编程光照培养箱（宁波莱福科技有限公司）；微量移液器（德国 Eppendorf）；光照振荡培养箱（江苏太仓华利达实验室设备公司）；5417R型高速冷冻离心机（德国 Eppendorf）；PCR仪（美国ABI）；DM6000B 光学显微镜（德国  leika）；冰箱（海尔集团）；凝胶成像系统（Tanon）；电子分析天平（Mettler Toledo PL203）；pH计（Mettler Toledo DELTA 320）；磁力搅拌器（JB-3）；HH-4 型数显恒温水浴锅（金坛市富华电器有限公司）；电热鼓风干燥箱（101-2型）。

1。3培养基

M1培养基 :可溶性淀粉0。25g，蛋白胨0。1g，酵母浸粉0。05g，甘油磷酸钠0。01g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。

R2A 培养基：胰蛋白胨0。25g，酸水解酪蛋白0。5g，酵母浸粉0。5g，可溶性淀粉0。5g，磷酸氢二钾0。3g，硫酸镁0。1g，丙酮酸钠0。3g，蛋白胨0。25g，葡萄糖0。5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml。

牛肉膏蛋白胨培养基(以下简称NB)：牛肉膏3g,蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。

稀释100倍牛肉膏蛋白胨培养基(以下简称DNB)：牛肉膏0。05g,蛋白胨0。1g，氯化钠0。05g，蒸馏水1000ml。

LB液体（固体）培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，（琼脂 15g）。

将上述各类培养基的PH根据样品PH来调节，分装后，121℃高压灭菌20分钟，备用。

1。4菌株的分离纯化

称取10g沉积物样品放入盛有90 ml灭菌生理盐水的锥形瓶(含玻璃珠)中，180 r/min振荡30 min。静置使其自然沉降，取上清用无菌水分别进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6稀释液100ul，涂布于M1培养基、R2A 培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和稀释100倍牛肉膏蛋白胨培养基上，每个梯度涂布3块平板作为平行实验，涂布后的平板用保鲜膜包好，将平板倒置于28℃培养箱，培养5-7天，待长出明显菌落后进行菌落计数，挑取不同表型特征的单菌落，反复划线分离至获得纯化菌株，试管斜面4℃保藏，每隔数月转接一次。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766- (责任编辑：qin)