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2。2  方法 11

2。2。1  基因的克隆与测序 11

2。2。2 CHS 基因表达量的测定 15

2。2。3  植物表达载体的构建 16

2。2。4  农杆菌 EHA105 介导的矮牵牛的遗传转化 20

第三章 结果与分析 25

3。1  基因的克隆与测序 25

3。2 CHS 基因表达量的测定 28

3。3  植物表达载体的构建 28

3。4  农杆菌 EHA105 介导的矮牵牛的遗传转化 29

3。5  讨论 31

结 论 33

致 谢 34

参考文献 35

第一章 绪论

1。1  基因克隆得到花色变异植株

随着现代科技的进步，从植物基因组众多基因中克隆出某一目的基因已不再 困难，现如今分离目的基因的方法日渐增多，如 PCR 扩增法，转座子标签法， 蛋白质纯化法等等，我们已经用这些基本的方法分离了众多花青素合成过程中的 结构基因和调节基因。序列相似的调节基因主要有 Sn,R,B 和 Ls，同源基因主要 有玉米的 C1 基因和 P1 基因，玉米的 C1 基因和 P1 基因与 An2 基因有高度的重 合率[1]。花青素合成在植物界中具有极高的保守型，这些控制调节花青素合成的 基因都有着高度的一致性。利用基因工程的技术和手段，对这些因子加以改造或 重组，使得到花色变异植株成为可能并逐步实现[5]。

以下策略是得到花色变异植株的主要途径：

（1）将其他植物的结构基因直接导入受体植株 一些植物的花色是由多个复合基因同时控制的，但有些植物的花色仅由单个

基因控制，在这种植物中，如果缺少合成某种花色的基因，就可以将其他物种的 该基因直接导入该植株的受体系统中诱导其表达。如今见到的多种植物花色是以 前自然界不存在的，比如蓝色玫瑰等等，迄今为止，矮牵牛是第一个利用基因的 方法改变花色的物种。将玉米的 DFR 基因导入矮牵牛突变体受体植株，由于该 基因编码的酶具有还原性，成功将矮牵牛花青素合成过程中的一个中间产物还原， 得到新的中间产物影响花色的表型，花色由白色变成淡红色，一个新的矮牵牛花 系就此产生，同时为基因改变性状打开了一扇新的大门。控制 F3´5´H 酶合成的 基因是 Hf1 和 Hf2，这两个基因目前已被成功分离[2]，若这两个基因同时在植株 中得到表达，那植株的花色就会产生大量的翠雀素-3-葡糖苷,由于翠雀素-3-葡糖 苷的堆积，植株花色变蓝。如向合成花青素但缺乏翠雀素-3-葡糖苷的玫瑰品种 中同时转化 Hf1 基因和 Hf2 基因，花青素的合成量会逐渐减少，而翠雀素的合 成量会逐渐增加，因此最终得到蓝色玫瑰品种。

（2）导入抑制内源基因活性的反义基因

有科学家在早在 1990 年发现，当将某个结构基因的多个复制产物同时导入 受体植株时，对应的此植物的内源基因的表达量几乎全部受到抑制。也有科学家

研究表明，当把 CHS 的多个拷贝转化整合到植物体后,该植株的花色发生改变， 究其原因，是该植物的内源 CHS 的表达量大大下降。反义基因共抑制的原理是 将某一基因倒序与植物表达载体连接，构建新的植物表达载体，将这种载体导入 植物体内，倒序的基因转录出的 RNA 与植物体内存在基因的 RNA 发生碱基互 (责任编辑：qin)