细胞色素P450是一种单加氧酶，以血红素铁卟啉为辅基。昆虫P450基因的克隆与分析早已取得了长足的发展，但对水生昆虫中蜻蜓目的P450基因的研究，却很少。作者通过翻阅文献发现，蜻蜓目HSP家族基因的资料也相当有限。本章主要通过高通量测序，克隆出白尾灰蜻稚虫P450和HSP90基因的中间片段。并研究了P450和HSP90两个基因的中间序列在五个浓度梯度的Cr6+溶液中的表达程度。

2。1 材料与方法

2。1。1。 供试昆虫

白尾灰蜻稚虫取自于杭州师范大学池塘(水质较为干净)，并在人工气候室中，将其放入ddH2O中饲养5~7天。根据国家水质标准以及农田等水系排放的标准，以及改进的寇氏法，测得K2Cr2O7对白尾灰蜻稚虫24h的 LC50为40 mg/L, 设定实验组所用Cr6+ 的浓度分别为0、0。05、0。1、0。5和20 mg/L。每个浓度设置两个重复组，每组随机放入10头形态完整、龄期相近的的白尾灰蜻稚虫。每隔3天，取各浓度的白尾灰蜻稚虫3只，将其洗净分别装管贴上标签存于超低温冰箱中，待进一步处理及分析。

2。1。2。 主要试剂和溶液

2。1。2。1。 酶和主要试剂

提取总RNA用Trizol试剂盒购自Invitrogen公司（Invitrogen, USA），氯仿、异丙醇、无水乙醇等购自上海生工生物工程有限公司；用于定量反转录的试剂盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）购自于TaKaRa（TaKaRa:DRR047s）；rTaq DNA聚合酶、dNTP、PCR buffer、pMD18-T Vector、TransTaq DNA聚合酶HiFi、Marker III、MarkerV购自北京全式金生物技术有限公司；Omega胶回收试剂盒；SsoFastTM EvaGreen® Supermix购自BioRad生物公司（Bio-Rad，USA）。

2。1。2。2。 常用溶液与配方

  1)10×TAE缓冲液配制方法：①称量Tris 48。4g，EDTA 3。722g于1L烧杯中；②向烧杯中加入约800ml ddH2O以及加入11。4ml的冰乙酸，搅拌混匀；④用NaOH调pH至8。3，加去离子水定容至1L后，室温保存。使用时，稀释10倍，即为1×TAE。

  2)100ml氨苄LB固体培养基：蛋白胨（peptone）1g；氯化钠 1g；琼脂1。5g；酵母浸粉 0。5g，加蒸馏水溶解，高压灭菌20分钟,，待液体冷却到一定温度加入氨苄，摇匀后均匀倒板，待凝固后，Parafilm封口膜将培养皿封好保存。

  3) LB液体培养基：胰蛋白胨：2。5g、酵母提取物：1。25g、氯化钠：2。5g、H2O：250ml。摇动容器直至溶质溶解，用NaOH调pH至7。0，用去离子水定容；在高压下蒸汽灭菌15min，分管装置。

2。1。3。 主要仪器设备

    5424常温离心机、5810R高转速低温离心机（德国Eppendorf公司），DNA电泳仪（北京六一仪器厂），紫外凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），ME104E电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），AM-3250C磁力搅拌器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），制冰机，高湿高压灭菌锅（江阴滨江医疗设备厂），DK-8D型恒温水浴锅（上海精宏设备有限公司）、Bio-Rad CFX96TM system定量PCR仪。文献综述

2。1。4。 实验方法

2。1。4。1。 白尾灰蜻P450，HSP90基因中间片段的克隆

2。1。4。1。1。 总RNA的提取

    1) 用匀浆器研磨之前冻好的水虿幼虫，转入进口 1。5ml EP 管。

2) 加入 1ml Trizol，用力震荡 10 分钟，室温静置 5 分钟。

3) 加入 200 μl氯仿，混合后室温静置 5 分钟。