以NT1的总DNA为模板，进行20μl体系的PCR温度梯度反应，退火温度为55℃-61℃；反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果来确定退火温度。

20μl体系的PCR反应：无菌水13.1μl，10×Buffer5μl，dNTP5μl，Mgcl2 1μl，引物各1μl，KOD酶0.4μl，NT1 0.5μl。

PCR反应条件：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃-61℃ 30s，68℃ 30s，35个循环；68℃ 10min。

2.2.5  基因片段的克隆

分别以NT1、NT7基因组DNA为模板，扩增C4H基因部分片段。

PCR扩增反应50μl体系：10×Buffer 5μl，无菌水33.6μl，Mgcl2 2.4μl，引物94F 1μl，dNTP5μl，引物1386R 1μl，KOD酶1μl，NT1、NT7各1μl。

PCR反应条件：95℃ 3min；95℃ 30s，56.2℃ 30s，68℃ 30s，35个循环；68℃ 10min。待PCR反应结束后，分别加入0.5μl的Taq酶，72℃保温半小时。保温结束后进行琼脂糖凝胶电泳。

2.2.6 胶回收

用AxyPrep DNA胶回收试剂盒。具体操作步骤：在紫外灯下小心的切下含有目的基因的DNA琼脂糖凝胶，放入提前称过重量的1.5ml离心管中，计算凝胶的重量，并作为作为一个凝胶体积（如：100mg=100ul）；加入3个体积的Buffer  DE-A，混合后放在65℃水浴锅中，每2min混合一次；凝胶完全熔化后加0.5个体积的Buffer DE-B，混匀；吸取混合液转移到DNA制备管中，10000rpm离心1min，弃滤液；加500ul Buffer W1,10000r离心30s，弃滤液；加700ul Buffer W2，10000r离心30s，源!自`优尔'文"论(文`网[www.youerw.com弃滤液；加700ul Buffer W2，10000r离心1min，弃滤液；离心1min；将制备管放到1.5ml离心管中，加25μlEluent，静置1min，10000r离心1min洗脱DNA；将DNA保存在 -20℃冰箱中。

2.2.7 目的片段与载体的连接、转化

按照TaKaRa公司提供的试剂盒进行连接与转化：DNA 4μl，pMD18-T Vector 1μl，SolutionⅠ 5μl，4℃连接过夜。加入50μl大肠杆菌作为感受态细胞源!自`优尔'文"论(文`网[www.youerw.com，放在冰上30min后在42℃水浴锅中热激45s；热激结束后立即放在冰上，时间1min。加入300μlSOC培养液，37℃、200r/min摇床预培养1小时。预培养结束后，将菌液用枪头混匀，然后涂布在含有X-Gal、IPTG、抗生素的LB固体培养基上，在37℃恒温培养箱中培养12h，形成单菌落。选择白色菌落，进行PCR确定载体中插入片段长度的大小，将阳性菌接种在含有抗生素的液体培养基中，放在摇床37℃、200r/min培养过夜。

2.2.8  测序

取灭过菌的1.5ml离心管，将菌液倒入，用封口膜把管口密封，送到公司测序。

2.2.9  基因序列的比对

通过DNAMAN软件对NT1、NT7扩增的基因序列与cDNA进行碱基比对，分析变异的位点。