1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1样品采集：用已灭菌的塑料瓶取海拔0米，东经119.25°北纬24.13°的东海海水。

1.1.2培养基：Solution A: 22.79 g 氯化钠，3.98 g 硫酸钠，0.72 g 氯化钾，0.27 g 氯化铵，47.2 mg 磷酸氢二钠，83 mg 溴化钠，31 mg 碳酸氢钠，27 mg硼酸，2.6 mg氟化钠，1.3 g TAPSO，890 ml蒸馏水，调节PH至7.6，高温高压灭菌；Solution B：11.18 g 六水合氯化镁，1.46 g 二水和氯化钙，24 mg 六水合氯化锶，100 ml 蒸馏水，高温高压灭菌；Solution C:0.02 g 四水合四氯化铁，100 ml 蒸馏水，G6玻璃砂漏斗过滤灭菌[7]；海水无机液体培养基：890 ml Solution A，100 毫升 Solution B，10ml Solution C；海水营养液体培养基：890 ml Solution A，100 毫升 Solution B，10 ml Solution C，2 g/L 胰蛋白胨，1 g/L 酵母提取物；海水营养固体培养基：890 ml Solution A，100 ml Solution B，10 ml Solution C，2 g/L 胰蛋白胨，1 g/L 酵母提取物，2%琼脂粉。

1.1.3其他仪器与试剂：高压蒸汽灭菌锅；摇床；离心机；PCR仪；冰箱；恒温培养箱；显微镜；凝胶成像仪；超净台；琼脂糖；上海生工PCR扩增试剂盒；API 20NE标准比色卡（含附加试剂）；路哥尔氏（Lugol）碘液；草酸铵结晶紫染液；95%乙醇；番红染液；EB染液；香柏油；50X TAE Buffer: Tris 242 g ，二水合乙二胺四乙酸二钠37.2 g， 57.1 ml 冰乙酸，调节PH至8.3，去离子水(ddH2O)加至1升。

1.2 RC菌株的分离纯化

取东海海水20毫升加入到将木质素作为唯一碳源的海水液体无机培养基中，设定温度为30℃，转速250 r/min，摇床培养48小时，重复上述步骤3次。培养3代后，逐级梯度稀释菌液，在超净台中取200微升菌液分别加入到海水营养固体培养基表面上用玻璃涂布器涂布分离获得单菌落[8]。再用三区划线法划线对菌株进行纯化。培养得到单菌落后一部分用无菌超纯水洗脱，用40%甘油在-70℃一下超低温保存备用[9-10]，另一部分的单菌落用于以下实验研究。为了便于研究，将得到的菌株命名为RC菌株。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

1.3 RC菌株的鉴定

1.3.1 用菌落PCR法对RC菌株的16S rDNA序列进行扩增：挑取平板上的单菌落配制成菌悬液，用加热煮沸法破坏细菌的细胞壁，用上海生物工程有限公司的PCR扩增试剂盒对RC菌株的16S rDNA进行扩增，PCR试剂使用配方如下表1-1所示，其中上游引物为Escherichia coli bases 8to27: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,下游引物为Escherichia coli bases 1507to1492: 5’-TACCTTGTTACGACTT -3’ [11]。50微升体系PCR试剂使用量与PCR条件[12