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2.3实验方法

2.3.1耳组织DNA的提取[19]

具体操作步骤如下：

1、天平称量约20mg的湖羊耳组织，去毛后置于1.5mL EP管中，编号并剪碎；

2、向每份样品中分别加入500 μL DNA抽提缓冲液和10 μL蛋白酶K，混匀后放置于水浴摇床内振荡消化12-16h（温度为56℃）；

3、将消化了一夜的样品取出，分别加入相同体积（约500 μL）的饱和酚，上下颠倒摇匀，10分钟后离心（12000rpm，10min）；

4、吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混摇10min后离心（12000rpm，10min）；

5、吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混摇10min后离心（12000rpm，10min）；

6、吸取上清液，加入两倍体积的-20℃预冷的冰乙醇，并于-20℃冰柜内静置半小时左右，离心（12000rpm，10min）；

7、将乙醇吸除，用预冷（-20℃）的75%的乙醇洗涤，离心（12000rpm，10min）后再次除去乙醇，室温下静置干燥；

8、加入100μL灭菌的DEPC超纯水使DNA溶解，放置于-20℃冰箱内保存备用。

2.3.2 DNA浓度和纯度检测

（1）琼脂糖凝胶电泳检测：

A、实验前将凝胶制胶盘、电泳槽、电泳梳等实验工具洗净并晾干；

B、天平称取0.3g琼脂糖，量取30 mL 0.5×TBE缓冲液混于锥形瓶中，在微波炉中加热融化1 min，即成1%琼脂糖凝胶液；

C、待溶液稍冷却至50-60℃左右时，加入2 μL核酸染料轻摇混匀；

D、将琼脂糖溶液缓慢倒入制胶盘中，插上规格大小合适的电泳梳。在此过程中要避免气泡的产生，若出现气泡应尽快处理。

E、室温自然放置约20min使胶体凝固，后缓慢拔掉电泳梳，并将制胶盘放入加有0.5×TBE缓冲液的电泳槽中；

F、吸取2 μL待检的DNA样品与1 μL 10×Loading Buffer混匀后点样，同时取3 μL的DNA MarkerⅢ上样对比；

G、盖上电泳槽盖，设置电压（150 V）、电流（100 mA），电泳30 min；

H、电泳完毕后，小心取出凝胶，在紫外灯下拍照并保存。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

（2）紫外分光光度法检测：

用紫外分光光度仪分别测定样品在波长260 nm和280 nm处的OD值，并计算OD260/OD280，若结果接近1.8，则说明DNA样品较纯。 湖羊TGFBR2基因遗传多样性初步分析(4):http://www.youerw.com/shengwu/lunwen_81359.html