（8）电泳仪

（9）凝胶成像仪

（10）光照培养箱

2。4研究方法

2。4。1 cDNA-AFLP分离亚洲棉、司笃克氏棉和体细胞杂种纤维发育阶段的差异表达基因

首先取用三个棉种0、5、10、15、20和25 DPA的子房，在冰上剥出胚珠，分离出纤维和种皮，然后立即放入加了液氮的研钵中，马上研磨成粉末，之后在用RNA提取试剂盒（TIANGEN总RNA抽提试剂盒）抽提RNA；每个棉种各个时期纤维RNA以相等的量混合，混匀的RNA用反转录试剂盒（Quantscript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒KP103）反转录成cDNA用于AFLP；AFLP参考Wendel实验室的操作流程，首先将cDNA用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ（NEB）进行双酶切，接头复性，再将cDNA酶切产物与复性接头进行连接反应；然后再对连接产物立刻进行PCR预扩和选扩；将扩增产物PAGE胶电泳分离差异表达片段并且需要挖胶回收，然后需要连接到T载体上进行测序。

过程：（1）DNA的提取。DNA的质量是一个非常重要的因素。与CTAB法或者其他类型的隔离方法，我们通过膜分离技术可以得到更高质量的DNA。我们使用QIAGEN的 DNeasy mini试剂盒能产生较多的高质量的DNA并进行AFLP分析。该试剂盒的唯一重要的偏差在步骤4。我们可以选择5分钟自旋这一点，因为在加入缓冲剂AP2会形成了大量的沉淀。只有上清液用于丁香碎纸机柱（与应用管的全部内容）。

消化/连接反应。虽然其他实验室已经成功了。当结合消化的基因组DNA和连接的适配器在一个反应，我们发现这一步是有问题的。在单独的步骤中进行时，消化和连接反应已经成功得多。这可能是因为限制性内切酶和连接酶之间酶活性的最佳温度之间的差异。我们如何做到这一点，消化：来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

试剂 用量(UL)

DNA 200NG

10X RE buffer 2。0

RE#1 10units

RE#2 10units

Dh2O XX

T0TAL 20。0

总反应体积为20微升。我们使用大约200NG在消化DNA。相应地调整蒸馏水量。孵育在37℃下3小时。立即进行连接反应。

准备适配器。ECO RI适配器与MSE I 适配器。(4)结扎。（5）预选择扩大。选择性扩增。

得到结果。

将测序所得结果和雷蒙德氏棉基因组测序信息与已公开发表的纤维发育相关ESTs数据进行blast比对和分析，找到相似度较高的同源基因，然后电子克隆基因的全长序列，并根据每条序列附注的GO和KEGG分析注释进行功能分类，初步筛选与棉花纤维发育密切相关的候选基因。