黑曲霉液体发酵产蛋白酶工艺条件研究(2)
3.8.3 不同温度对于黑曲霉发酵产蛋白酶酶活的影响 3
3.9发酵条件的优化 3
4.实验总结 3
致谢 3
参考文献 3
1.绪论
蛋白酶的品种多，应用广,这方面的研究颇为热门，每年都有二、三百篇研究报告，从国外研究动向看仍着重于新品种的发掘, 并通过发酵条件及遗传育种获得高产蛋白酶的优良菌种。在酶的纯化手段方面, 采用了亲和层析圈等电点聚焦及分子筛等新技术, 快速而有效的获得理想的纯品, 为蛋白酶对底物作用的特异性研究提供了条件。H.Holzer和H.Tschesche 对蛋白酶的生物学功能作了详细的介绍, 有很多科学工作者从事这方面的研究, 为医学研究作出重要贡献。Jnichir.yagi 等对头抱霉菌属 ( Cephalosporium) 产生的碱性蛋白酶进行较细致的底物特异性的研究, 在水解氧化胰岛素B链中发现至少有16 个不同的肤类, 它在眯氨酸, 谷酞胺, 组氨酸和酪氨酸残基的特殊位置上进行水解, 显然与胰蛋白酶, 胃蛋白酶等性质不同。蛋白酶不仅能分解肤链, 而且能合成肚链, 森原和之用a-糜蛋白酶等在适当条件下合成了肤链, 我国科学家在胰岛素人工合成中也已采用了这种技术。
目前工业用酶大多数来自微生物，经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞的生命活动获得所需酶的技术过程称为酶的发酵生产。用于酶发酵生产的微生物必须具备的条件有酶的产量高，容易培养和管理，酶稳定性好，利于酶的分离纯化，安全可靠。常用的产酶微生物包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，霉菌。据统计，在550种酶制剂中有近三分之一是霉菌产生的。影响微生物蛋白酶生产的因素十分复杂,同一微生物因培养条件不同可产生多种蛋白酶,芽孢杆菌大多数是好气性不产毒素和非致病性的,培养容易,广泛用于中性和碱性蛋白酶的生产,真菌主要是曲霉 (米曲霉、黑曲霉) ,根霉、毛霉和栗疫霉也是生产中性和酸性蛋白酶的菌种,生产用的菌株都是符合美国GRAS的菌种,米曲霉可产中性、碱性和酸性蛋白酶,黑曲霉、根霉只产酸性蛋白酶,而栖土曲霉产生中性和碱性蛋白酶,栗疫霉、毛霉生产凝乳型的酶。微生物蛋白酶酶系组成复杂,同一种酶用电泳、层析等分离技术还可分离出若干在分子量、氨基酸组成、最适pH、温度及等电点等各异的组成,用免疫学抗原抗体反应也可以看出酶的氨基酸序列和构象上的异同。细菌的中、碱性蛋白酶通常是用液体深层培养法生产,而霉菌蛋白酶则更适于采用固体培养法生产,固体培养不易污染,管理容易,节省能源,单位容器产量高,日本和欧洲不少工厂广为采用。但需要注意,在两种培养方式下,同一菌种所产蛋白酶即使在相同活性水平下,有时固体培养的实用效果更好。固体培养物经过辐照或环氧乙烷灭菌处理,视用途不同而可直接作为粗酶来使用以降低成本,例如用于饲料添加剂、制革工业或其它。微生物生产蛋白酶与生长相有关,芽孢杆菌中性蛋白酶在对数生长期与细胞生长同步产生,而碱性蛋白酶则在对数生长期末芽孢形成时大量生成,芽孢形成起到产酶的触发作用。不能形成芽孢的突变株一般不能大量合成碱性蛋白酶,丧失蛋白酶合成能力的突变株不能形成芽孢。曲霉固体培养时,蛋白酶活性在分生孢子老熟时达到最大值,液体培养时当菌体衰老自溶时,蛋白酶活性达到高峰。菌种突变或培养条件变化能使产酶期或酶系组成发生变动。
近二十年来我国蛋白酶研究取得很大进展, 至目前已生产和应用过的蛋白酶品种已有21种之多, 广泛用于丝绸脱胶, 皮革脱毛, 毛皮软化, 电影废胶片回收, 生化药物生产及用作医药和洗涤剂等。在基础研究方面, 正在开展酶的纯化, 以探索酶的作用机制物化性质, 更进一步弄清其对底物作用的特异性。我国蛋白酶研究已经达到了分子水平，利用基因工程手段和蛋白质工程手段定向改造蛋白酶产生菌产酶活力及酶学性质是今后很长时间的一个发展趋势。随着生物技术基础研究的深入和应用技术手段的完善，蛋白酶研究将会进入一个全新的阶段。今后，我国蛋白酶研究方向主要转向：⑴继续运用生物技术和蛋白质手段进一步提高目前工业微生物菌种产酶能力和酶的性质。如构建、克隆高产蛋白酶基因文库并高效表达，选育耐热、耐碱、抗噬菌体和抗氧化高产蛋白酶菌株等。⑵建立新的蛋白酶高产基因宿主系统，为蛋白酶构建更多的表达载体，解决革兰氏阴性胞外酶分泌问题。⑶为蛋白酶的应用开拓新的渠道，特别是在医学(生物制药及化疗等)及生物技术领域中的应用。⑷选育极端性蛋白酶产生菌。如低温性蛋白酶产生菌、耐高温性蛋白酶。还有人准备通过酶的组份分析来搞清其脱毛机理等。但是蛋白酶的研究还存在不少问题, 例如: 应用面还不够广, 品种还需增加, 如动物体中存在的各种蛋白酶还可以从微生物中去发掘。此外随着生物学及分子生物学, 遗传工程研究的发展, 迫切需要有更多的专一性更强的蛋白酶作为工具, 这方面的研究也正待加强。蛋白酶在临床化验方面的应用也是值得探索的, 蛋白酶的基础研究和应用基础研究也需着手进行, 但目前还处于萌芽阶段。
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