乳酸菌亚硝酸盐还原酶相关基因的研究(2)
1.2.1 生长曲线的测定 9
1.2.2 亚硝酸钠的测定：盐酸萘乙二胺法 10
1.3 实验结果 11
1.3.1 菌株生长曲线测定 11
1.3.1 菌株亚硝酸盐降解曲线测定 12
1.4 讨论 13
第二章 nir疑似基因片段的检测与菌种鉴定 14
2.1 实验材料与试剂 14
2.1.1 实验菌种 14
2.1.2 试剂 14
2.1.3 实验设备 14
2.2 生物信息学分析 14
2.2.1 生物信息学分析软件 14
2.2.2 方法 14
2.2.3 结果 15
2.3 实验方法 16
2.3.1 总DNA的提取 16
2.3.2 各引物进行常规PCR或touchdownPCR 16
2.3.3 条带割胶回收 16
2.3.4 测序 17
2.4 结果 17
2.4.1 电泳结果 17
2.4.2 疑似亚硝酸盐还原酶片段的测序 17
2.5 讨论 19
第3章 亚硝酸盐胁迫下转录调控 21
3.1 实验材料与试剂 21
3.1.1 实验菌种 21
3.1.2 试剂与设备 21
3.2 生物信息学分析 21
3.2.1 生物信息学分析软件 21
3.2.2 方法 21
3.2.3 结果 22
3.3 实验方法 23
3.3.1 培养与取样 23
3.3.2 总RNA抽提 23
3.3.3 逆转录（合成cDNA第一链） 23
3.3.4 荧光定量PCR检测 24
3.4 结果 24
3.4.1 取样时的亚硝酸盐浓度 24
3.4.2 各管抽提总RNA的结果 24
3.4.3 real-time PCR检测结果 25
3.5 讨论 27
第四章 HP基因启动子的研究 29
4.1 生物信息学分析软件 29
4.2 方法 29
4.3 结果 29
4.4 讨论 30
第三部分 结论与展望 31
1 结论 31
2 展望 31
致谢 32
参考文献 33
第一部分 绪论
第一章 文献综述
1.1乳酸菌中亚硝酸还原酶研究进展
乳酸菌对于人类来说属于益生菌，在功能性食品和传统发酵食品中有着非常广泛的应用。相关研究表明，在接种乳酸菌发酵泡菜过程中，泡菜中亚硝酸盐能得到显著降解[17-19]。张庆芳等[1]对乳酸菌降解亚硝酸盐的机理进行了研究，并将乳酸菌对亚硝酸盐的降解分为酶降解和酸降解2个阶段。在pH＞4.5时以亚硝酸盐还原酶降解为主；在pH<4.0时，此时酶活力受到抑制，亚硝酸盐的降解主要以酸降解为主。亚硝酸盐还原酶是一类能催化亚硝酸盐还原的酶[2]，是氮循环过程中的关键酶，广泛存在于微生物及植物体内，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
有研究报道，在腌制蔬菜制品过程中接种优良的乳酸菌种，可明显降低蔬菜中的亚硝酸盐[3-7]。其原因是乳酸菌的生长繁殖会抑制硝酸盐还原菌的生长，从而减少亚硝酸盐的生成，同时乳酸菌会合成亚硝酸盐还原酶，可以有效的降解亚硝酸盐，其降解因素主要取决于乳酸菌开始生长的速度和发酵初期有害微生物被抑制的速度[8]。同时，在发酵蔬菜制品中接种优良乳酸菌，不仅具有降解亚硝酸盐、防腐的作用，其代谢过程中能够产生大量对有益人体健康的次级代谢产物，还有利于腌制后的榨菜色泽鲜艳和风的改善[9]。徐俐等[10]将植物乳杆菌应用于酸汤的制备工艺中，通过在酸汤中人工接种植物乳杆菌进行发酵，并与自然发酵进行比较，研究人工接种对酸汤中亚硝酸盐的影响。研究表明人工接种不但可以有效控制亚硝酸盐的产生，而且可以明显缩短发酵时间，改善酸汤风，提高产品安全性。Esmaeilzadeh等[11]将乳酸菌应用于发酵香肠中，研究其对香肠中亚硝酸盐的影响。结果显示接种植物乳杆菌的发酵香肠中亚硝酸盐含量相比于初始含量减少了86.6%，而自然发酵香肠中亚硝酸盐只减少了29%。同时乳酸菌发酵后的代谢产物可以有效抑制有害微生物的生长，提高发酵香肠的风。