不同温度对蚂蟥幼苗生长和免疫影响(2)
随着水蛭研究的日渐深入，水蛭人工饲养方法逐渐完善，并代替自然捕捞成为主流，但由于蚂蟥生长的影响因素过多，目前仍有许多问题有待解决。目前已从呼吸生理、消化生理、养殖密度、投喂方法、繁殖特性等方面对蚂蟥进行了研究。温度是影响动物生长和免疫的重要因素，过高或过低会导致免疫力低下或死亡率升高，在适宜的温度下动物体内各种酶活性最高，国内外一些研究表明，水生动物在其消化酶的最适温度下消化酶活性最高，一般情况下鱼类消化酶的最适温度在30℃到60℃之间，数值分散，一般在40℃左右[18]。研究表明，成年蚂蟥适宜生长的温度是25℃左右[19]，蚂蟥幼苗适宜生长的温度稍高于此温度，在低温下蚂蟥虽然前期死亡率较低，但免疫力低下，后期出现大量死亡现象，本实验探究不同温度对蚂蟥幼苗生长及免疫的影响，以期为蚂蟥室内养殖提供科学依据和指导。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
幼龄蚂蟥的经由南京农业大学中药研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)。
FA1104分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC-200，bio-RAD）；FYL-YS-108L低温保存箱（北京福意电器有限公司）；5810R离心机（Eppendorf公司）。
1.2 方法
1.2.1 实验设计
将实验分为3组，每组20瓶，每瓶20条，水温由高到低分别为23℃、28℃、33℃，每三天换水一次，其他养殖条件相同，实验期为45天。每15天称重，每组取9条蚂蟥（每3条1组，重复3次）分别在液氮中保存，后期进行实验测定。
1.2.2 生长性能的测定[4]
存活率：SR= Nt /No ×100% ；特定生长率：SGR = ( lnWt － lnWo) /t ×100% ；增重率：WGR=(Wt －Wo)/Wo ×100%
式中W0为实验开始时蚂蟥的平均质量( g) ，Wt为结束时蚂蟥的平均质量( g) ，t 为实验天数( d),No为实验开始时蚂蟥的条数，Nt为实验结束时蚂蟥的条数。
1.2.3 生长及免疫相关酶基因表达的测定[5]
RNA提取 将蚂蟥组织放入研钵中，待完全冷冻后，迅速研磨成粉末，始终保持研钵内有液氮。将粉末移入1.5ml装有1ml Triz01的EP管中，剧烈震荡15s，并在室温放置3min。配平，4℃，12000r，10min离心。称取0.25g凝胶粉末溶解于250mlTAE(x :取50xTAE母液20ml，定容至1000ml)液体中，制胶，冷却20nin以上，后将胶移至电泳液中；第一步离心结束后，取上清液至另一离心管（勿吸到底部）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀10次（轻轻），室温放置2~3min，配平，4℃，12000r，10min离心。样品分三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIZ01试剂的60%。（上层液最多有400µl，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，记录抽取的量一般为200µl，防止抽到中下层）。在上述第三步的EP管中加入等体积（200µl）预冷的异丙醇，轻轻混匀（配平）。4℃，12000r，离心10min，离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀，弃上清，用75%乙醇（DEPC水配制）洗涤RNA胶样沉淀（将底部RNA胶样沉淀轻轻弹起，摇晃洗涤）4℃，7500r，离心，弃上清，室温干燥一会（或用200µl枪头吸尽75%乙醇），视RNA量，入30~50µl的DEPC水溶解。点2µl Loading buffer N个样（N=取得样品数+1）置于一次性塑料手套上，去4µl Marker和N个样品RNA液与buffer吸打混匀，点样。140v 15min,跑胶。
RNA反转录cDNA 取5×gDNA Eraser Buffer 2.0 L，gDNA Eraser 1.0 L，模板RNA液 7.0 L，RNase Free dH2O 0 L，体系总量达到 10 L后，以微型离心机混匀，42℃在 PCR扩增仪上以反转录3、FZL3反应2min（或者室温下5min），反应体系液10 L，PCR扩增仪选择加热体积时选择15 L。 在反转录3的反应液中加5×Primer Script Buffer 2（for real time）4.0 L，Primer Script® RT Enzyme mix 1（取底部），RT Primer Mix 1.0 L，RNase Free dH2O 4.0 L，体系总量达到 20 L后，用微型离心机轻微离心混匀，42℃ 在 PCR扩增仪上以反转录4、FZL4反应2min（或者室温下5min），反应体系液25 L，PCR扩增仪选择加热体积时选择25 L，反应完成后，保存于洁净试管盒中，记清日期和标号，置于-20℃中长期保存（可保存半年）。
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