水稻早期花药发育相关RING类E3连接酶的筛选(2)
1.2.3 水稻中的研究进展4
1.3 本课题研究意义4
第二章 材料与方法4
2.1 材料„4
2.1.1 菌种4
2.1.2 载体与文库„5
2.1.3 试剂与试剂盒5
2.2 方法„5
2.2.1 基因扩增5
2.2.2 琼脂糖凝胶 DNA 回收„5
2.2.3 基于 Gateway™技术的载体克隆„5
2.2.4 热激法转化感受态大肠杆菌6
2.2.5 大肠杆菌质粒小量提取6
2.2.6 小量酵母转化与双杂交6
2.2.7 文库规模酵母转化与双杂交7
2.2.8 酵母质粒小量提取7
2.2.9 基于MEGA软件的分子进化树构建8
第三章 实验结果„8
3.1 RING类E3连接酶与负反馈调节通路的寻找„8
3.1.1 RNA-Seq 数据分析与进化树构建8
3.1.2 酵母双杂交验证10
3.2 MPL 的酵母双杂交文库筛选„11
3.2.1 文库信息与筛选思路11
3.2.2 转化效率计算与阳性菌落验证11
3.2.3 筛选获得RING类E3连接酶进化树构建„12
第四章 讨论与展望13
4.1 毕业设计工作小结13
4.2 双分子震荡模型„13
4.3 工作展望14
致谢15
参考文献15
附录 A 主要引物列表„16
附录 B 主要培养基与缓冲液配方19
附录 C 主要载体图谱„20 第一章 文献综述与研究背景
1．1 水稻早期花药发育
开花植物产生雌雄配子体以完成双受精过程。雄配子的正常发育对于植物形成有功
能的花粉和受精后产生合子必不可少。水稻早期花药发育的过程是由一系列有序的细胞
分裂与分化组成。相应的，其分子调控网络也是复杂而有序的。重要调控因子的失活都
有可能引发整个水稻花药发育失败。关于水稻花药发育调控的分子机制虽然已有部分报
道，但目前关于早期花药发育的调控机制特别是花药内细胞命运的决定机制还很不清楚。
1．1．1 水稻早期花药细胞分化过程
水稻花药发育过程一般可分为十二个时期。伴随着不同细胞的分化和增殖，花药内
细胞由原基时期的三层细胞逐渐发育为形态功能各异的多层细胞。水稻早期花药发育即
减数分裂发生之前（时期七之前）细胞命运的决定如下所示。
花药内细胞的命运见下表一[1]~[2]。
时期一：花原基分化产生雄蕊原基，雄蕊原基中产生 L1、L2、L3三层细胞。
时期二：雄蕊分生组织形成了带四个角的花药原基。在四个角处各有一个源于 L2
层（L2-derived，L2-d）的细胞分化为孢原细胞。
时期三：孢原细胞经过一次不均等的平周分裂，形成了初生壁细胞（Primary Parietal
Cell，PPC）和初生造孢细胞（Primary Sporogenous Cell，PSC）。
时期四：初生壁细胞经过均等的平周分裂形成内外两层的次生壁细胞（Secondary Parietal Cell，SPC）。
时期五：初生造孢细胞开始分裂，产生次生造孢细胞（Secondary Sporogenous Cell，
SSC）。与此同时，内层次生壁细胞分裂产生中层（Middle Layer， ML）和绒毡层（Tapetum，
T），外层次生壁细胞分化为药室内壁（Endothecium，En）。
时期优尔：小孢子母细胞（Microspore Mother Cell，MMC）形成，被四层花药壁细胞包围。
时期七：小孢子母细胞与绒毡层接触，开始进行减数分裂，中层细胞变窄，成为带状结构。
1．1．2 水稻花药发育早期的调控
现已知的在水稻花药发育早期调控细胞分裂与分化，决定细胞命运的基因很少。
MSP1和 TDL1A/MIL2 基因是目前已知的仅有的两个重要调控因子。
MSP1编码富含亮氨酸的受体蛋白激酶，该蛋白是拟南芥中EMS1/EXS的同源蛋白。