蛋白质能直观、全面反映生物体的各种功能和作用机制，在生命代谢和调控途径中作为主要执行者存在。蛋白标志物是疾病标志物（也称生物标志物，Biomarker）的一种，由于蛋白质是大多数药物和致病因子的靶分子，在疾病中蛋白标志物可作为一个特征性的生化指标[12]。在蛋白标志物筛选中，SELDI-TOF-MS（surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,表面加强激光解析电离飞行时间质谱）技术是目前蛋白质组学主要应用的技术之一，可用于观察病人体液中蛋白质的动态变化，其原理是利用激光照射样本使样本离子化，可在电场中飞行，不同质荷比（m/z）的离子到达检测器的时间也不同，分子量越小，离子飞行时间越短，反之则长。据此获得数据，通过仪器分析绘制得到蛋白质谱图，再经软件分析所得处理过的数据，可得到所需的蛋白峰，最后用生物信息学比较处理，得到各项数据。SELDI-TOF-MS技术具有操作简便，具有可使用少量原始样本，检测快速，重复性好，高通量的特点[13,14]。

在此技术基础上发展而来的纳米磁珠结合SELDI-TOF-MS技术又称液体芯片-飞行时间质谱技术。应用此技术在肿瘤血清差异蛋白筛选研究中[15]，筛选获得了一些特异性和敏感性都较高的蛋白标志物，为研究疾病标志物提供了新的方法，显示了该技术广阔的应用前景。

本研究中选取不同控制水平的哮喘儿童为研究对象，取患儿血清做样本，采用纳米磁珠结合SELDI-TOF-MS技术建立蛋白质图谱，将所得的蛋白质图谱进行统计对比，寻找差异蛋白峰，研究这不同控制水平的哮喘儿童血清蛋白的表达差异性，以期寻找儿童哮喘不同控制水平的标志性蛋白。

2 材料与方法

2。1 实验材料

2。1。1病例诊断分组

儿童哮喘诊断标准：参照中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的儿童哮喘诊断标准。按GINA方案（2009）评估哮喘控制水平，借助C-ACT问卷测试建立两种不同病情控制水平的儿童哮喘组：儿童哮喘完全控制组和儿童哮喘未控制组。收集两种哮喘控制水平的儿童哮喘样本45例，年龄范围在4-12岁。

2。1。2样本收集

抽取3 mL儿童哮喘完全控制组和儿童哮喘未控制组患者的周围静脉全血样本，抽血时间需在凌晨5-7时，空腹状态下。然后将存放样本的采血管立即转移到4℃环境下垂直放置1-2 h，使血液凝结，再以4℃、4000 g离心10 min，将上层血清分装在0。5 mL离心管中，每管30 µl，置于-80℃冰箱备用（注：避免反复冻融）。样本编号要与病历资料对应，并建立病历资料库。

2。1。3试剂和耗材论文网

2。1。3。1试剂

碘乙酞胺(IAM)购自德国Apphchem公司；二硫苏糖醇(DTT)购自美国Sigma-Aldrich公司；色谱级纯度乙腈（ACN）、色谱级纯度甲酸（FA）、色谱级纯度甲醇、色谱级纯度水均购自美国J。 T。 Baker公司；芥子酸 (SA)购自美国Ciphergen公司；尿素(Urea)，3-环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)购自美国Promega公司；乙酸钠购自上海生工生程公司；三氟乙酸(TFA)购自瑞士Fluka公司；HEPES购自美国Sigma-Aldrich公司；All-in-one protein standard II购自美国Bio-Rad公司；Monoisotopic、Cytochrome C、α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）购自美国Sigma-Aldrich公司。

2。1。3。2耗材

WCX磁珠，CM10芯片购自北京SED Science & Technology公司；磁性分离板购自美国Ciphergen公司；PCR，96孔板及封口膜购自美国Axygen公司；塑料离心管（0。2 mL、0。6 mL、1。5 mL、2。5 mL）购自美国Axygen公司；10 mL采血管购自美国BD公司；Au芯片购自美国Ciphergen公司。

2。1。4缓冲液及溶液配制