degQ调控Fengycin合成机理研究(2)
芽孢杆菌能通过非核糖体途径，利用非核糖体多酶复合体（non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs）合成多类具有生物活性的抗菌物质。这类多酶复合体由多个模块（modules）按照特定空间顺序排列而成，每一个模块负责将一个特定的底物整合到产物的骨架中。NRPSs需要4′-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（sfp基因编码）进行修饰之后，才具有全酶活性。该酶能够将辅酶A上的4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移到NRPSs中的肽酰载体蛋白（peptidyl carrier protein，PCP）保守的丝氨酸残基侧链羟基之上，从而使载体蛋白由无活性的脱辅基（apo-）形式转变为活性全蛋白（holo-）形式。肽酰载体蛋白负责NRPSs途径的底物固定，是合成脂肽化合物如surfactin、fengycin、bcillomycin D、bacillibactin等所必需的酶[1,2]。
枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株是研究芽孢杆菌的模式菌株，全基因组序列于1997年完成测序。BS168菌株中含有两种NRPSs, 分别是srf和pps操纵子，分别负责合成表面活性素（surfactin）和泛革素（fengycin）。但由于该菌株的sfp基因突变，导致不能合成这两类物质。并且还有研究表明，BS168菌株产生fengycin还受另外一个基因deg Q的调控。在BS168菌株中，由于degQ基因的启动子部分发生突变，致使其不能成功转录。当恢复该菌株中的sfp和deg Q表型后，该菌能产生fengycin。前期研究也表明，将来自解淀粉芽孢杆菌FZB42中的sfp基因导入BS168，并且同时deg Q的启动子替换为强启动子P43，则能使该菌株产生抑制真菌物质fengycin，但是deg Q调控fengycin的机理未知。
Fengycin是由10个氨基酸组成的多肽和1个C13-17-β-羟基脂肪酸链所构成，其中多肽上的第3 和第10位的氨基酸通过内酯键形成环状结构，并且根据环肽上氨基酸的不同分为fengycin A、fengycin B和fengycin C[3,4]。Fengycin合成酶的操纵子（pps operon）具有5个开放阅读框，编码Pps A-E 5个蛋白，组成10个氨基酸活化模块。Fengycin具有很强的抑制真菌活性，它能够穿透磷脂双分子层，打破脂质层的有序性，加强细胞质膜的渗透性，从而破坏细胞，是一种有效的磷脂及生物膜合成抑制剂[5,6]。已有研究证明，枯草芽胞杆菌BAB-1菌株所产生的Fengycin对番茄灰霉病菌表现较强的拮抗活性，造成灰霉病菌菌丝畸形、膨大，部分原生质体外渗。抑菌活性测定表明，fengycin在C06菌株抑制褐腐病菌( Monilinia fructicola)发挥主要作用。Yanez-Mendizabal等研究发现，尽管CPA-8 菌株可以产生fengycin、iturin A和surfactin等多种脂肽类抗生素，但不具备fengycin合成能力的突变子完全丧失了对M．fructicola的抑菌活性，该结果同样证明fengycin在抑菌活性中发挥主要的作用[7,8]。同时fengycin还可以作为激发子来诱导植物产生诱导性系统抗性(ISR)[9]。
本实验室有前期研究表明 degQ和sfp 2个功能基因共同存在时能提高fengycin合成酶基因簇的表达量，进而提高fengycin的产量。本实验敲除了枯草芽孢杆菌模式菌株168的调控因子degU，然后将前期已构建好的表达载体pMK3-sfp与pMK3-degQ-sfp，分别转入已敲除degU和未敲除degU的BS168中，得到4 株工程菌株。利用抑菌实验，质谱分析以及EMSA实验，对各菌株fengycin进行检测，来研究degQ是否通过双组份系统degU/degS途径影响fengycin的产生。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及菌株生长条件
本研究所用菌株为大肠杆菌E.coli Top10，枯草芽孢杆菌BS168，枯草芽孢杆菌BS168(sfp)（本实验室保存）和枯草芽孢杆菌BS168(sfp+degQ)（本实验室保存）。CRISPR-Cas9基因编辑质粒pJOE8999和大肠杆菌表达质粒pET28a（+）由本实验室保存。大肠杆菌和芽孢杆菌采用LB培养基，培养基成分为：蛋白陈1.0%，酵母膏0.5 %，氯化钠1.0%, pH 7.0，加1.5%琼脂为固体培养基。培养条件为37℃、200 r/min培养。提取枯草芽孢杆菌产生的脂肽化合物时使用Landy[10]等培养基进行发酵。培养油菜菌核病菌时采用PDA培养基，培养基成分为：马铃薯200 g/L,葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L， pH 7.0，培养条件为25℃培养。制备枯草芽孢杆菌168感受态细胞时，培养基采用SPI和SPII培养基，参照Spizizen[11]的方法进行培养。抗生素的终浓度为：氨苄青霉素100 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL。