重测序技术研究水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性机制(2)
1材料与方法
1.1供试菌株
水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）噻枯唑敏感性菌株ZJ173，本实验室经过前期筛选已经成功获得的噻枯唑抗药性菌株2-1-1[2]。
1.2培养条件
NB液体培养基（1 L）：
牛肉膏蛋白胨培养基（NB）1 L
牛肉浸膏 3 g
蛋白胨 5 g
酵母粉 1 g
蔗糖 10 g
加蒸馏水溶解后定容至1 L
将上述物质加入烧杯中，搅拌至完全溶解，用PH计调pH调至7.0~7.2，进行分装，之后在高温高压条件(121℃，110 kPa)下灭菌20 min。
NA固体培养基基本成分同上，每1000 mL液体培养基中加入20 g琼脂粉。
LB培养基（1L）
LB培养基1 L
多聚蛋白胨 10 g
酵母提取物 5 g
氯化钠 10 g
琼脂粉 20 g
加蒸馏水溶解后定容至1 L
定量称取上述物质于烧杯中，加超纯水至1000 ml, 用5mol/L NaOH（约0.2 ml）调pH至7.2，121℃灭菌20 min。
本研究所涉及的抗生素为卡那霉素（Kn）使用浓度为20 ppm。
Xoo菌株活化方法是：从原始菌株中蘸取少量菌体在NA培养基平板上划线分离培养出单菌落，在挑取单菌落于NB培养基中，放置于28℃摇床，175 rpm条件下，摇培20-48小时。
1.3实验仪器
本实验所依托的植物保护学院植物药理学与病害防控实验室长期从事分子生物方面相关研究，具有DNA提取试剂盒、RNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒等所需要的实验材料和PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、分光光度计、超低温冰箱、摇床、温箱、离心机、超净台等实验仪器。
2方法
2.1试剂盒提取ZJ173和2-1-1的基因组
使用从-80℃保存的原始菌液，可以减少ZJ173和2-1-1菌株培养过程基因变异的可能，加入到NB中培养浓度达到108 CFU ml−1后，参考天根细菌基因组提取试剂盒提取ZJ173和2-1-1菌株的基因组，之后用无菌水溶解测定DNA浓度。步骤如下：
1) 取细菌培养液1-5 ml，10 000 rpm离心1min，吸取上清。
2) 向菌体沉淀中加入200 μl缓冲液GA，震荡至菌体悬浮。
3) 向管中加入20 μl蛋白酶K溶液，混匀。
4) 加入220 μl缓冲液GB，震荡15 s，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心除去管壁水珠。
5) 加入220 ml无水乙醇，充分震荡混匀15 s，此时会出现絮状沉淀，简短离心去除管壁水珠。
6) 将上述所得溶液全部加入至吸附柱CB3中，12 000 rpm离心30 s，弃液。
7) 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD（检查是否入无水乙醇），12 000 rpm离心30s，弃液。
8) 向吸附柱加入600 μl漂洗液PW，12 000 rpm离心30 s，弃液。
9) 重复步骤8。
10) 空离2 min（12 000 rpm），室温静置数分钟，晾干吸附柱中多余漂洗液。
11) 将吸附柱转入干净的离心管中，加入50-200 μl洗脱缓冲液TE，室温静置2-5 min，12 000 rpm离心2 min收集于离心管中。
2.2 ZJ173和2-1-1的重测序与分析
由于重测序工作量较大，故DNA文库构建由北京诺禾致源公司完成，将DNA样品交给该公司。该公司接收到DNA样品后，对DNA样品进行检测；检测合格的样品构建小片段文库，构建小片段文库其步骤简述如下[4]：首先利用核酸外切酶把DNA样品随机打断，并收集所需长度的DNA片段，将DNA片段进行末端修复，在经过末端修复的DNA片段的3'末端加碱基“A”，使DNA片段能与3'端带有碱基“T”的特殊接头连接，获得目的片段。最后利用HiSeq TM2000平台将合格的文库进行cluster制备和测序，将所得结果过滤低质量的reads，保留高质量的reads，过滤后的数据称为clean data。通过序列比对的方法，将得到的clean data与参考基因组进行序列比对分析。根据比对情况检测样品的单核苷酸多态性位点（SNP）、插入和缺失位点（Insertion and deletion，InDel）和结构性变异位点（Structural variation，SV），并对SNP、InDel和SV结果注释。