1 材料与方法

1。1 土壤样品

土壤样品采自杭州西溪国家湿地公园5种土壤样地，分别是柿林（HS）、塘基（TJ）、农田（NT）、草地（CD）和滩涂（TT）。取表层土壤（0-10cm），4℃冰箱保存，用于富集分离。

1。2 培养基

异养硝化细菌富集培养基(1L)：葡萄糖 5g/L，（NH4）2SO4 2g/L，NaNO2 2g/L，NaCl 1g/L，FeSO4/7H2O 0。4g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 0。4g/L，MgSO4/7H2O 0。5g/L，蒸馏水 1L  PH7。3。

好氧反硝化细菌富集培养基(1L）：柠檬酸钠 5g/L，NaNO3 2g/L， KH2PO4 1g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4/7H2O 0。2g/L，蒸馏水1L，PH 7。3-7。6。

异养硝化细菌分离培养基(1L）：葡萄糖 5g/L，（NH4）2SO4 2g/L，(NaNO2 2g/L)，NaCl 1g/L，FeSO4/7H2O 0。4g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 0。4g/L，MgSO4/7H2O 0。5 g/L，蒸馏水 1L  PH 7。3，琼脂 20g/L。论文网

好氧反硝化细菌分离培养基（1L）：BTB培养基：KNO3 1g /L，KH2PO4 1g/L，FeCl2/6H2O 0。5g/L，CaCl2/7H2O 0。2g/L，MgSO4/7H2O 1g/L，琥珀酸钠8。5g/L，BTB(1。5%溴百里溶于无水乙醇)1ml/L PH7。2，  硝酸盐固体培养基：硝酸钾 0。2g/L，蛋白 5g/L，蒸馏水 1000mL，琼脂 20g/L，PH7。4。

LB液体培养基：酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 10g/L，PH 7。0~7。2

异养硝化细菌降解率测定培养基(1L）：分别以（NH4）2SO4或NaNO2作为唯一氮源，蔗糖作为碳源，5g，无机盐同分离培养基，培养基初始氨氮、亚硝态氮浓度按50mg/L加入。

1。3 试剂

奈斯勒试剂：KI 20g溶于50g水中，再加HgCl2至饱和，再加460ml水和134g KOH。

格里斯式试剂：A液：对氨基苯磺酸   0。5g

                        稀醋酸（10%） 150ml

                  B液：α-萘胺         0。1g

                        蒸馏水         20ml

                        稀醋酸（10%） 150ml

二苯胺试剂：二苯胺0。5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。

1。4 细菌富集培养和分离

1。4。1异养硝化细菌富集培养和分离

取10g土壤加入100ml富集培养基中，置于30℃温度下，160r/min，培养4天，按10%接种量转接入新的富集培养基中培养，重复上述富集培养3次。

用无菌水将上述的富集培养液依次稀释成10-5、10-6、10-7、10-8共4个梯度，分别吸取各个稀释梯度0。2ml，涂布于以（NH4）2SO4为唯一氮源的分离培养基平板上，30℃恒温培养，选取形态不同的菌落进行反复划线分离纯化，直到得到单菌落的纯培养，最后斜面保存。

1。4。2好氧反硝化细菌富集培养和分离

取10g土壤加入100ml富集培养基中，置于30℃温度下，160r/min，每隔24h向培养液中加入5%KNO3 和5%NaNO2溶液1mL，重复上述富集培养5天。

用无菌水将上述的富集培养液依次稀释成10-5、10-6、10-7、10-8共4个梯度，分别吸取各个稀释梯度0。2ml，涂布于BTB培养基平板上，30℃恒温培养2-3天。由于反硝化反应是产碱过程，当有反硝化反应发生，会使BTB培养基的指示剂溴百里酚蓝呈现蓝色，即菌落会呈现蓝色或蓝色晕圈。从BTB培养基平板中挑选出蓝色晕圈的单菌落，平板上连续划线分离，直至获得纯培养物，4℃斜面保存。

1。5 脱氮菌的初筛

1。5。1异养硝化细菌的初筛文献综述

将上述分离得到的菌株接种到富集培养基中，30℃摇床培养24h，5000r/min离心10min，弃上清，再用0。85%生理盐水洗涤沉淀，再次离心，如此重复3次，以去除菌体培养过程中产生的无机氮素，最后用0。85%生理盐水制备菌悬液，按1%接种到分离液体培养基中，置于30℃，160r/min摇床培养48h。取1mL培养液，加入少量奈斯勒试剂，混匀后观察颜色变化。若培养液中铵离子浓度高，会呈现黄色或棕色；反之，无色。