蜜蜂螺原体黏附相关蛋白对宿主意蜂免疫的影响(3)
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ABI7500荧光定量PCR仪 试剂及配方：
表 2 主要试剂及配方
试剂 配方
CTAB 缓冲液
Tris-HCl(pH 8.0) 100 mmol/L、EDTA(pH 8.0) 20 mmol/L、NaCl 1.4
mmol/L、 CTAB 3% (W/V)、 PVP 40 5% (W/V)、 β-巯基乙醇 2% (V/V)
使用前加入
LB 培养基(1 L)
胰化蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 5 g、1m L 1mol/L NaOH
调pH 至7.4，用去离子水定容至 1L，高压蒸汽灭菌20 min。固体
培养基则还需加入 15 g琼脂或者琼脂糖
12%SDS-PAGE(50 mL)
蒸馏水 10 mL、 30%Acr-Bis(29:1) 20 mL、 1 mol/L Tris pH8.8 19 mL、
10%SDS 0.5 mL、10%过硫酸铵 0.5 mL、TEMED 0.02 mL
IPTG(10 mL)
在8 mL蒸馏水中溶解 2 g IPTG 后，用蒸馏水定容至10m L，用0.22
µ m滤器过滤除菌，分装即可
Binding Buffer(100 mL)
NaCl 23.376 g、Tris碱 1.9376 g、咪唑 3.2678 g，用蒸馏水定容至
100 mL，调节 pH至 7.9
Hank’s溶液(1 L)
KH2PO4 0.06 g、NaCl 8.0 g、NaHCO3 0.35 g、KCl 0.4 g、葡萄糖 1.0
g、 Na2HPO4·H2O 0.06 g，用蒸馏水定容至1 L，高压蒸汽灭菌20 min，
4℃保存
昆虫培养基(1 L)
Grace培养基40～50g、海藻糖0.5~3 g、酵母抽提物0.5~3g、胎牛
血清 100~200 mL，用蒸馏水定容至1L
第一抗体 抗ALP609蛋白兔抗(艾比玛特医疗科技有限公司)，以下简称一抗
第二抗体 Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔 IgG(碧云天)，以下简称二抗
Elution Buffer 一般为pH 8.0 的Tris盐酸
1．2实验方法
1．2．1 黏附蛋白基因定点突变
由于柔膜菌纲微生物基因组中 TGA 编码色氨酸而非终止密码子，故需要将目的基
因中的TGA片段突变为 TGG，使黏附蛋白ALP609 能在表达载体E. coli BL 21 中表达。
1．2．1．1螺原体总 DNA提取
S. melliferum CH-1以1%的接种量接种在 LB 液体培养基中，32℃培养至对数期，
收集菌体，利用改良 CTAB/NaCl 法提取螺原体基因组(俞徐斌，2013)。
1．2．1．2 螺原体黏附蛋白相关基因的扩增
根据基因序列，利用 Primer5 设计含有酶切位点的引物，扩增出突变后的 ALP609
基因全长。
表 3 本实验使用的引物
引物 序列(5’-3’)
609-2’ GGAATTCCATATGATGAAAAAATATTTAAGTATTTTA
609-3’ TTGTTGTTTTACCCAATCTAAAACTGTTGT
609-4’ ACAACAGTTTTAGATTGGGTAAAACAACAA
609-5’ CCGCTCGAGATCTTAAACTGTTGT
注：下划线为限制性酶切位点
突变碱基上下游两条基因序列扩增：
表 4 ALP609 (970bp)PCR扩增反应体系及程序
体系(总 25µ L) 使用量(µ L) 温度(℃) 时间
双蒸水 17
dNTPs 2 96 2 min
10 × pcr buffer 2.5 94 30s
CH-1 1 58 30s 38 个循环
609-5’ 1 72 1min 体系(总 25µ L) 使用量(µ L) 温度(℃) 时间
双蒸水 17
dNTPs 2 96 2 min
10 × pcr buffer 2.5 94 30s
CH-1 1 55 30s 38 个循环
609-3’ 1 72 1min
609-4’ 1 72 1min
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