摘要：螺原体缺少细胞壁，其细胞膜在侵染宿主的过程中扮演了重要的角色。螺原体细胞膜表面存在黏附相关蛋白，黏附蛋白与宿主细胞膜上的受体蛋白识别互作是侵染过程中的第一步。针对蜜蜂螺原体黏附相关蛋白ALP609，本文探究其在侵染过程中的作用。为此，我们建立了螺原体体外侵染意蜂中肠细胞的模型、设计了竞争结合试验和抗体抑制试验：分别用外源表达的黏附相关蛋白和其多克隆抗体孵育螺原体，再让其侵染体外培养的意蜂中肠细胞。在竞争试验中，加入外源黏附相关蛋白能够显著降低螺原体相对侵入率；在抗体抑制试验中，该黏附蛋白的多克隆抗体能显著降低螺原体相对黏附率和侵入率。研究结果表明，蜜蜂螺原体黏附相关蛋白ALP609在螺原体侵染宿主细胞过程中起到黏附作用，并能促进螺原体侵入。86088

毕业论文关键词：蜜蜂螺原体；黏附相关蛋白；竞争结合试验；抗体抑制试验

Functions of adhesin ALP609 in the process of Spiroplasma melliferum infecting host cells 

Abstract：The cytomembrane of spiroplamas play an important role in the process of infecting host cells as spiroplamas are cell wall-less。 Adhesion-related proteins are located on the surface of cytomembrane of spiroplamas。 The recognition and interaction between adhesin and receptor on host cell membrane is the first step during infection。 In this study, we investigated the effects of adhesin-like protein (ALP609) from Spiroplama melliferum in the process of infection。 We established a model of spiroplamas infecting midgut cells of Apis mellfera in vitro, and designed a competitive binding assay and antibody inhibition assay。 In competition experiments, adding adhesin protein ALP609 expressed in E。 coli BL21 could significantly reduce the relative invasion rate of spiroplamas。 In antibody inhibition assay, the polyclonal antibody of adhesin ALP609 could significantly reduce the relative adhesion rate and invasion rate。 In conclusion, adhesin ALP609 can help Spiroplama melliferum attach to the midgut cells of Apis mellfera, and promote  spiroplasma to infect host cells。

Key words: Spiroplama melliferum; adhesin; competitive binding assay; antibody inhibition assay

目  录

摘要1

关键词1

Abstract…1

Key words1

引言…1

1材料与方法…2

1。1 菌株与蜜蜂…2

1。2培养基 …2

1。3 主要试剂及配制2

1。4仪器3

1。5 实验技术及方法…3

1。5。1 黏附蛋白的表达与纯化3

1。5。2黏附蛋白的除盐与浓缩4

1。5。3考马斯亮蓝法测定蛋白含量4

1。5。4意蜂中肠细胞的分离培养… 4

1。5。5 黏附蛋白在侵染过程中的作用5

1。5。5。1竞争结合实验 … 5

1。5。5。2 抗体抑制实验 …   5

2 结果与分析… 5

2。1 螺原体黏附蛋白的表达与纯化5

2。2黏附蛋白含量的测定6

2。3 意蜂中肠细胞的分离与培养…6

2。4 黏附蛋白在螺原体侵染宿主细胞过程中的作用… … …7

2。4。1 竞争结合实验  … …7

2。4。2 抗体抑制实验…  … 7

3 讨论…    … …8

致谢。。。… … … …  … … … … … …8

参考文献…    …8

黏附相关蛋白ALP609在蜜蜂螺原体侵染宿主细胞过程中的作用研究

螺原体是一类非常特殊的微生物，最早发现于上世纪七十年代[1]。螺原体和宿主之间的关系可分为共生(mutualism)、互生(commensalism)和致病(pathogenicity) 3 种，多数螺原体与宿主的关系为共生或互生[2]。其宿主主要为植物[3]、昆虫和水生甲壳动物[4]，也有部分螺原体分离自哺乳动物[5]。螺原体一般有以下几个主要特征：（1）体积小，可滤过0。22 μm 的微孔滤膜；（2）无细胞壁，细胞膜具有三层结构，由蛋白质和脂质组成[6], 位于菌体的最外层作为屏障；（3）形态具有多样性，在对数期呈现螺旋形，而在平台期和衰亡期呈现球形、哑铃型和蝌蚪型等不规则形态[7]；（4）具有运动性[8]，可在人工培养基中培养[9]；（5）基因组小，G+C含量低。基因组大小在780-2200 kbp，G+C含量在26%左右。