(1)IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)溶液:

在8 mL蒸馏水中溶解2 g IPTG后,用蒸馏水定容至10 mL,用0。22 μm滤器过滤除菌,分装成1 mL小份贮存于-20 ℃。

(2)考马斯亮蓝R-250染色液:

考马斯亮蓝R-250 1 g溶于250 mL异丙醇,加入100 mL冰醋酸。去离子水补足至1 L,滤纸除去颗粒物,室温保存。

(3)考马斯亮蓝G-250显色液:

考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95 %乙醇,加入 100 mL 85 %磷酸,用蒸馏水稀释到1000 mL,室温保存。

(4)1× PBS缓冲液:

8 g NaCl,0。2 g KCl,1。44 g Na2HPO4,0。24 g KH2PO4溶于800 mL蒸馏水,调节pH至7。4,双蒸水定容至1 L。

(5)脱色液:论文网

冰醋酸100 mL,乙醇50 mL,去离子水850 mL,充分混匀。

 (6)咪唑母液(1 M):

6。808 g咪唑溶于100 mL去离子水,根据情况稀释使用。

(7)抗生素浓度及配制:

庆大霉素(50 mg/mL):溶解500 mg硫酸庆大霉素于足量的去离子水中,最后定容至10ml,分装成小份于-20 ℃贮存。工作浓度40 μg/mL。

卡那霉素(10 mg/mL):溶解100 mg卡那霉素于足量的水中,最后定容至10 ml,分装成小份于-20 ℃贮存。工作浓度50 μg/mL。

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自Solarbio,5×蛋白上样缓冲液、低分子量Protein Marker购自TaKaRa,牛血清白蛋白及胰蛋白酶购自Sigma,ALP609多克隆抗体购自艾比玛特。 

1.4  仪器

   立式压力蒸汽灭菌锅、超净工作台、紫外分光光度计、电子天平、磁力加热搅拌器、全自动凝胶成像分析仪、冰箱、高速离心机、冷冻离心机、涡旋混合器、稳流稳压电泳仪、光学显微镜、恒温培养摇床、脱色摇床、微波炉、垂直电泳槽、超声波破碎仪、恒温水浴锅、生化培养箱

1.5  实验技术及方法

1.5.1  黏附相关蛋白的表达与纯化

(1)活化:取一支灭菌试管,向其中加入100 μL保藏的菌种和3 mL LB液体培养基,37 ℃恒温摇床过夜培养。

(2)扩大培养:按照菌液:培养基=1:100比例扩大培养,向300 mL培养基中加入100 μL卡那霉素,再加菌液混匀,相同条件下培养至OD600值0。6-0。8左右(约2。5 h)。

(3)诱导:向菌液中加入30 mL IPTG,27 ℃诱导3 h。

(4)收菌:将诱导后的菌液 分装至两个500 mL离心瓶中,5000 rpm离心10 min。弃掉上清,向其中一瓶加入10 mL Tris-HCl缓冲液吹打均匀,菌悬液移至另一瓶中,再次吹打均匀。

(5)破壁、收样:将菌液转移至塑料离心管中,用泡沫板固定置于盛有冰水的烧杯中,超声波破壁20 min(注意:塑料管需固定牢靠以防破碎时晃动从而损害仪器)。将破壁后的菌液转移到离心管中,13000 rpm离心15 min,上清-20 ℃保存。

(6)表达的蛋白样品中含有杂蛋白,为了后续实验的进行需对蛋白样品进行纯化。纯化前取出1 mL作为对照,余下样品用于纯化。本实验使用镍柱纯化,具体步骤如下:

①洗镍柱:先后加入300 mM咪唑和超纯水,体积分别为6倍和9倍柱床体积(6 ×V和9 ×V)。

②平衡:缓慢加入6 ×V 5 mM咪唑,平衡之后不要再动柱子。文献综述

③上样:蛋白样品经0。22 μm滤器过滤后,在4 ℃冰箱过柱子。

④除杂:梯度浓度咪唑(6 ×V)洗脱,浓度依次为5 mM、20 mM、50 mM,每个浓度分6次滴加,收集第一管和最后一管。

⑤纯化:300 mM咪唑(6 ×V)洗脱,分6次滴加,每管都收集。收集液再重复本步一次。

⑥后续处理:样品全部流出后,待电泳确认最后一管无明显蛋白时即可处理镍柱:

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