6 ×V 300 mM咪唑处理30 min    10× V 0。5 mM NaOH溶液处理30 min    20× V超纯水清洗     10 ×V 20 %乙醇流出，加入少量20 %乙醇，4℃保存。纯化的蛋白电泳检测或-20℃保存备用。

（7）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达及纯化情况

①制备蛋白胶：先制备分离胶，待完全凝固后制备浓缩胶，胶的配方为：

    分离胶：ddH2O 2。68 mL; 1。5 mol/L Tris-HCl (pH 8。8) 2 mL; 10 % SDS 80 μL; Acr/Bis(30 %) 3。2 mL; TEMED 4 μL; 10 % APS（现配现用）40 μL

    浓缩胶：ddH2O 2 mL; 0。5 mol/L Tris-HCl(pH 6。8) 0。375 mL; Acr/Bis(30 %) 0。5 mL; 10 % SDS 30 μL; 10 %  APS（现配现用）30 μL; TEMED 2 μL

②上样：上样体系为20 μL样品+5 μL Buffer，混匀后沸水浴2 min。 上样时从左至右依次为Marker 5 μL、大肠杆菌BL21空载、粘附蛋白（未纯化）、纯化蛋白，各10 μL。

③电泳：先在80 V下电泳，待进入分离胶时提高至 120 V。溴酚蓝指示带至底端时结束电泳。

④染色观察：取下凝胶，加考马斯亮蓝R-250染色液。微波炉加热2 min，脱色摇床上染色5 min。回收染色液，清水洗涤3次，加入脱色液，在摇床上脱色过夜。观察、拍照，分析电泳结果。

1．5．2  黏附相关蛋白的除盐及浓缩来自~优尔、论文|网www.youerw.com +QQ752018766-

经镍柱纯化后的黏附相关蛋白样品中，含有高浓度的咪唑，需要对样品进行脱盐处理；为了得到较高浓度的蛋白溶液，还需进一步浓缩，步骤如下：

（1）从4 ℃冰箱取2支盛有超纯水的超滤管，移液枪轻轻吹吸滤膜，彻底取出残留的蛋白。

（2）倒掉超纯水，加入蛋白样品（不能超过最高刻度线），配平。4 ℃低温离心机离心（5000 rpm，25 min），倒掉滤出液。

（3）加入PBS缓冲液，配平，继续离心30 min。重复3次，逐步置换出高盐溶液。收集浓缩液，可得较高浓度的纯化蛋白。

1．5．3  考马斯亮蓝法测定蛋白含量

测定蛋白含量使用考马斯亮蓝G-250作为显色剂，牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，步骤如下：

取六根试管，依次加入0、0。2、0。4、0。6、0。8、1。0 mL BSA（0。1 mg/mL），按照下表配制好溶液并测定各管在595 nm处的吸光值OD595，绘制标准曲线。