蚂蟥冬眠期间细胞凋亡与自噬相关基因表达的研究(2)
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物
实验用蚂蟥由南京农业大学中药材研究所蚂蟥实验室提供，经史红专副教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；实验所用螺蛳（采自南京前湖，野生）为梨形环棱螺Bellamya purificata Heude。
1.1.2实验仪器
电子天平（山海精密仪器厂）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC-200，bio-RAD）；电泳仪（DYY-6C，北京优尔一仪器厂）；凝胶成像仪（JS-380，上海培清科技有限公司）；SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)（上海皓嘉科技发展有限公司）；PrimeScript. RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) （上海皓嘉科技发展有限公司）
1.1.3实验试剂
loading buffer；Marker；TRIzol；RNAiso plus（宝生物工程有限公司（大连））；琼脂；氯仿；异丙醇；乙醇
1.2方法
1.2.1实验设计
实验用蚂蟥采自南京农业大学中药材研究所蚂蟥实验室，选取健康蚂蟥（Whitmania pigra）活体材料100条，体重约为15 g，根据冬眠周期分为5组处理，分别为：
（1）对照组（active leeches，AC）
（2）初冬眠组（entrance into hibernation，EH）
（3）深冬眠组（deep hibernation，DH）（4℃以下培养超过50天）
（4）早期苏醒组（early arousal，EA）（深冬眠的蚂蟥复温25℃，0.5h）
（5）出冬眠活跃组（active after hibernation，AAH）
每组随机选取3条蚂蟥，至于盛水2/3广口玻璃瓶中。