自1904年纤维素酶被发现以来，人们已得知纤维素酶是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的应用十分广泛，如在喂养牲畜的饲料中添加纤维素酶，可将饲料中不易被牲畜消化的纤维素降解为可消化的糖和蛋白质，提高了饲料的利用率；在豆制品制作中添加纤维素酶可提高出品率；经纤维素酶处理过的棉麻等纺织品，品质更高。碱性纤维素则可用于去污。纤维素酶的分子结构中包括两个与纤维素降解有关的结构域：纤维素结合结构域（CBH）和纤维素催化结构域（CD）。两者之间通过富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸的柔软短肽连接。以催化性质为分类依据，纤维素酶可分为：外切酶，降解纤维素形成纤维二糖；内切酶，可作用于长链纤维素；β-葡萄糖苷酶，可水解多种纤维寡糖。纤维素的降解由三种酶共同参与（过程如图2）[4]。但纤维素酶的稳定性差，酶降解效率低，导致纤维素酶的应用成本较高。目前多采用分子生物学技术和蛋白质工程学技术对酶分子结构进行改造来解决这些问题[5]。

纤维素 外切葡聚糖苷酶 纤维寡糖 β-葡萄糖苷酶 葡萄糖内切葡聚糖苷酶

图2 纤维素水解过程                 

1。3 β-葡萄糖苷酶

Liebig和Wohler于1837年在苦杏仁汁中首次发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase），又称β-D-葡萄糖苷水解酶，又名纤维二糖酶、苦杏仁苷酶和龙胆二糖酶，属于水解酶类。β-葡萄糖苷酶的作用底物非常多，根据底物特异性，β-葡萄糖苷酶可以被分为芳基葡萄糖苷酶（作用于芳基-β-葡萄糖苷）、纤维二糖酶（水解纤维二糖）和多底物特异性酶（可作用于多种底物）。目前为止，大多数β-葡萄糖苷酶都被归为最后一类。正是由于β-葡萄糖苷酶的多种作用，使β-葡萄糖苷酶广泛分布在自然界中，对于生物的新陈代谢具有重要的意义。多种植物、动物、真菌、细菌及古菌体内都含有β-葡萄糖苷酶。由于它的结构和组成不同，造成不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量差异很大。多数β-葡萄糖苷酶耐酸碱，最适温度在40-110℃范围内，相对分子质量40-250kD不等[6]。β-葡萄糖苷酶的分子结构中起催化作用的是两个谷氨酸残基，其中一个起酸/碱作用，另一个起亲核试剂的作用 [7]。β-葡萄糖苷酶在纤维素水解中具有双重作用：一方面将外切-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶水解形成的纤维二糖降解为葡萄糖，葡萄糖作为自然界中最简单的单糖，取代纤维素成为菌优先利用的碳源，从而抑制了纤维素酶的合成；另一方面，β-葡萄糖苷酶可通过转糖基作用，将纤维二糖转化为槐糖-纤维素酶表达的诱导剂，从而使纤维素酶表达水平升高[8]。研究发现，β-葡萄糖苷酶在纤维素的水解过程中起着关键作用，是纤维素水解成葡萄糖的限制因素。在植物中，β-葡萄糖苷酶与细胞壁的形成有关，同时还参与了色素代谢，果实成熟等过程。人体吸收利用大豆中的异黄酮需要β-葡萄糖苷酶的水解酶作用，只有将异黄酮降解为苷元才能被小肠绒毛主动吸收利用。

1。4 里氏木霉论文网

大肠杆菌蛋白分泌能力低且产生的纤维素酶提取困难，因此不适宜用于工业中纤维素酶的大规模生产，而酵母中表达的纤维素酶在翻译后修饰中糖基化程度过高。丝状真菌如本实验转化的受体菌里氏木霉是低等真核生物的一大家族，大多数的丝状真菌是腐生生物，他们通过产生大量的不同种类的酶以消化死亡有机物质中的高聚物，例如纤维素等。很多的丝状真菌具有较高的蛋白分泌能力而被广泛应用于同源或异源蛋白质生产。此外，丝状真菌还是研究基本细胞和分子过程的重要的模式系统。选择里氏木霉作为纤维素酶转化受体的优点在于：合成的纤维素酶大部分为胞外酶,便于提取;另外表达的纤维素酶活性比其他微生物好;对环境适应能力强,便于培养。里氏木霉中含有11种β-葡萄糖苷酶编码基因，其中bgl1/cel3a，cel1a，cel1b三个β-葡萄糖苷酶基因可快速响应在纤维素、乳糖等碳源诱导，是里氏木霉最主要的β-葡萄糖苷酶编码基因。研究表明，里氏木霉β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中有着重要的作用，但是详细的作用机制并不清楚。徐金涛[8]利用基因敲除技术，构建一系列β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株，在纤维素诱导下，分别绘制生长曲线并测定酶活力，利用Northenblot、qRT-PCR测定cbh1转录和表达情况。结果表明，cel1b基因缺失菌株酶活力无明显变化，bgl1/cel3a，cel1a基因缺失菌株酶活力变化较大，且cbh1转录和表达明显降低。说明Bgl1/Cel3a，Cel1a是对纤维素酶表达的影响较大。