三氯乙酸对棉铃对位叶光合产物输出的影响研究(3)
韧皮部阻断如果要作为一种技术运用到科学研究中，其作用效果以及其效果的时限性、稳定性均需要达到一定水平。本试验在对阻断方法进行改进之后，对改进后的处理结果进行了分析，以期来论证该方法在实际研究中的可靠性和可利用性。
1 材料与方法
1．1 试验设计
在南京农业大学牌楼试验站塑料遮雨棚棚中，盆栽种植高温敏感性棉花品种（苏棉15）和耐高温棉花品种（PHY370WR），自然温度下培养至第4-5果枝第一果节蕾开花，于开花当日挂牌标记当日所开白花及其棉铃对位叶。选用三氯乙酸（TCA）作为阻断剂，设置不同的浓度（5%、10%、15%、20%、25%、30%），分别在上午9时左右和傍晚18时左右对不同花后天数的棉铃对位叶叶柄进行涂抹处理。次日观察处理后叶片的外观，并测定其净光合速率和SPAD值，明确韧皮部阻断的最适浓度及最佳处理时间。
通过对花后15天棉铃对位叶韧皮部进行最优实验条件下的阻断处理后，测定阻断后叶片内相关物质的含量。同时，采用含有13C标记的二氧化碳饲喂相应叶片，一小时后取样保存，用于测定其13C的丰度。通过分析叶片中可溶性糖/蔗糖/淀粉的含量水平与未阻断处理叶片之间的变化，结合阻断处理和对照间13C的差异，计算阻断处理对光合产物的阻断效果。结合其他手段，明确该实验条件下对韧皮部运输的阻断效果。
1．2 测定内容和方法
1．2．1 净光合速率和SPAD值的测定
1．2．2 棉铃对位叶中蔗糖和淀粉含量的测定 取烘干棉铃对位叶0.1 g放入10 mL离心管中，加5 mL 80%酒精后80oC提取30 min，然后在67 g离心5 min，将上清液倾入25 mL容量瓶。重复提取两次，收集上清液于容量瓶。合并离心液于25 mL容量瓶中用蒸馏水定容，用间苯二酚显色法测定样品中蔗糖含量。
向提完糖的沉淀中加水2 mL。搅拌均匀，至于80oC水浴中使残留的乙醇蒸发，再放入沸水浴中糊化15 min，冷却后，将离心管放入冰水浴中，加入2 mL冷的9.2 mol L–1高氯酸，不时搅拌，提取15 min后加水4 mL。混匀离心10 min，上清倾入25 mL容量瓶。再向沉淀中加入2 mL 4.6 mol L–1高氯酸，搅拌提取15 min后加水6 mL，混匀离心10 min，收集上清液于容量瓶。然后用水洗沉淀1-2次，离心，合并离心液于50 mL容量瓶中用蒸馏水定容后，采用硫酸蒽酮显色法测定样品中淀粉含量。
1．2．3 13C丰度的测定 对标记叶片进行含13C的二氧化碳气体饲喂，一小时后将部分叶片取下保存，作为对照。次日将其余部分叶片取下，采用元素分析仪—同位素质谱仪（EA—IRMS）联用技术，测定13C丰度。
1．2．4 数据处理与分析 采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理及作图，用SPSS 11.0统计分析软件进行方差分析。采用LSR法进行差异显著性比较，显著性水平设定为 α =0.05。
2 结果与分析
2．1 阻断效果随阻断处理时长的变化
叶柄韧皮部阻断在阻断当天对相对应叶片的净光合速率影响不明显，但在阻断处理的次日，叶片净光合速率会极显著的降低，5天的动态测定结果如图1。从图中可以看出在处理后1天，其数据最为集中离散程度最小，2天后净光合速率降至最小。离散程度随时间增加不断增加。综合阻断后净光合速率的下降幅度和数据的离散性可以确定，阻断1天后进行试验取样最具有代表性。