番茄miR482编码基因克隆及过表达转基因植株构建筛选(2)
蜡质芽胞杆菌AR156是本实验室从森林树木根围土壤中分离的一株植物根围促生细菌（PGPR），可广谱性防治茄劳尔氏菌引起的蔬菜青枯病、优尔椒疫霉引起的疫病、尖孢镰刀菌引起的枯萎病和南方根结线虫引起的根结线虫病。前期研究表明，蜡质芽胞杆菌AR156通过同时激活SA、JA/ET两个信号通路诱导拟南芥及番茄产生系统抗病性，同时伴随着细胞水平上的活性氧迸发、胼胝质沉积和染色质凝集等现象的发生，以及分子水平上的SAR、ISR标志基因的表达。在对AR156诱导系统抗性过程中不同时间点取样并进行高通量测序时，我们发现sly-miR482在AR156处理后表达丰度明显降低，Northern blot检测结果和测序结果一致。因此我们假设sly-miR482在蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物产生系统抗性过程中起着重要的作用。
植物miRNA基因多位于编码基因之间，在Ⅱ型RNA聚合酶转录作用下，形成初级转录miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA可以形成发夹形状的颈环结构，再被截切成前体miRNA(pre-miRNA),后进一步加工，形成成熟的miRNA双联聚合（miRNA:miRAN*）。miRNA:miRAN*经DCL1剪切后，由HEN1蛋白进行甲基化作用，之后释放到细胞质中发挥功能。
在遗传转化方面，目前最有效的途径之一就是以根癌农杆菌介导。根癌农杆菌对植物释放的化学物质产生趋化反应，向植物受伤组织集中。经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜，使Ti质粒上的Vir基因活化，Vir基因产物使Ti质粒上的T-DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。插入在T-DNA左右边界区域的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。
本研究主要探讨利用Gateway克隆技术对sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d、sly-miR482e分别进行克隆，及使用农杆菌介导的叶盘转化法获得其过表达转基因植株。进而为后期解析sly-miR482在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物系统抗性过程中的作用机制提供植株研究材料，为揭示小分子RNA调控生防菌诱导植物系统抗性的作用机制。
1 材料与方法
1．1 材料
番茄材料Micro Tom，pENTR/D-TOPO质粒与pEG100质粒为本实验室保存，农杆菌菌株EHA105，大肠杆菌菌株E.coli top10。提取菌株质粒及番茄基因组使用Axygen公司的AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，凝胶电泳回收使用Thermo公司的GeneJET Gel Extraction Kit。构建载体使用Invitrogen公司的Gateway LR Clonase Enzyme Mix及pENTR/SD/D-TOPO Cloning Kit。基因克隆使用Thermo公司的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。用于检测sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d、sly-miR482e的引物如表1。
表1引物序列
F(5’-3’) R(5’-3’)
Sly-miR482a CACCAAGGTCCCCTCAATGGCTA ATTTACCTGATGATAGCAGTAGTGA
Sly-miR482b CACCGTAAACTTAATAGGACACGATGGT CTCAGAAACAAAATGGGTACG
Sly-miR482c CACCTCATCATATATAGAAGCCATTGGAG CATCCTTCGTACATATAAGAGTTGC
Sly-miR482d CACCCAAACATATTAGATTACTCCGACAAG GAGATTGTCATGCACCACTCTTA
Sly-miR482e CACCGTGACTGAATAAAATAATGTAACCCC TGAATCAGATTCTAACCTAATCGAAC
35S G ACGCACAATCCCACTATCC
M13 TGTAAAACGACGGCCAGT
1．2 方法
1.2.1 目的基因材料准备
通过PCR，以前期研究中提取的番茄基因为模板，分别获得sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d、sly-miR482e的大量片段。通过验证后，使用试剂盒进行胶回收，将回收的基因片段与pENTR/D-TOPO过渡载体相连，通过化学转化的方法，将含目的基因的过渡载体转入大肠杆菌E.coli top10中。通过菌落PCR的方法验证得到阳性子，富集大肠杆菌阳性子，并提取质粒。将提取的质粒做酶切，获得含有目的基因的片段，并将其连接上最终载体pEG100质粒。将含有目的基因的最终载体通过化学转化的方法，转入大肠杆菌中，并验证得到阳性子。富集阳性大肠杆菌，提取其质粒，通过电转化的方法，将其转入农杆菌EHA105中，并验证得到阳性子。