蜡质芽胞杆菌AR156是本实验室从森林树木根围土壤中分离的一株植物根围促生细菌(PGPR),可广谱性防治茄劳尔氏菌引起的蔬菜青枯病、优尔椒疫霉引起的疫病、尖孢镰刀菌引起的枯萎病和南方根结线虫引起的根结线虫病。前期研究表明,蜡质芽胞杆菌AR156通过同时激活SA、JA/ET两个信号通路诱导拟南芥及番茄产生系统抗病性,同时伴随着细胞水平上的活性氧迸发、胼胝质沉积和染色质凝集等现象的发生,以及分子水平上的SAR、ISR标志基因的表达。在对AR156诱导系统抗性过程中不同时间点取样并进行高通量测序时,我们发现sly-miR482在AR156处理后表达丰度明显降低,Northern blot检测结果和测序结果一致。因此我们假设sly-miR482在蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物产生系统抗性过程中起着重要的作用。
植物miRNA基因多位于编码基因之间,在Ⅱ型RNA聚合酶转录作用下,形成初级转录miRNA(pri-miRNA),pri-miRNA可以形成发夹形状的颈环结构,再被截切成前体miRNA(pre-miRNA),后进一步加工,形成成熟的miRNA双联聚合(miRNA:miRAN*)。miRNA:miRAN*经DCL1剪切后,由HEN1蛋白进行甲基化作用,之后释放到细胞质中发挥功能。
在遗传转化方面,目前最有效的途径之一就是以根癌农杆菌介导。根癌农杆菌对植物释放的化学物质产生趋化反应,向植物受伤组织集中。经共培养后,受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,使Ti质粒上的Vir基因活化,Vir基因产物使Ti质粒上的T-DNA进入植物细胞,并整合到植物核基因组中。插入在T-DNA左右边界区域的目的基因也随之整合到植物染色体上,从而使目的基因在植物细胞中得到表达。
本研究主要探讨利用Gateway克隆技术对sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d、sly-miR482e分别进行克隆,及使用农杆菌介导的叶盘转化法获得其过表达转基因植株。进而为后期解析sly-miR482在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物系统抗性过程中的作用机制提供植株研究材料,为揭示小分子RNA调控生防菌诱导植物系统抗性的作用机制。
1  材料与方法
1.1  材料  
番茄材料Micro Tom,pENTR/D-TOPO质粒与pEG100质粒为本实验室保存,农杆菌菌株EHA105,大肠杆菌菌株E.coli top10。提取菌株质粒及番茄基因组使用Axygen公司的AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit,凝胶电泳回收使用Thermo公司的GeneJET Gel Extraction Kit。构建载体使用Invitrogen公司的Gateway LR Clonase Enzyme Mix及pENTR/SD/D-TOPO Cloning Kit。基因克隆使用Thermo公司的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。用于检测sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d、sly-miR482e的引物如表1。
表1引物序列
    F(5’-3’)    R(5’-3’)
Sly-miR482a    CACCAAGGTCCCCTCAATGGCTA    ATTTACCTGATGATAGCAGTAGTGA
Sly-miR482b    CACCGTAAACTTAATAGGACACGATGGT    CTCAGAAACAAAATGGGTACG
Sly-miR482c    CACCTCATCATATATAGAAGCCATTGGAG    CATCCTTCGTACATATAAGAGTTGC
Sly-miR482d    CACCCAAACATATTAGATTACTCCGACAAG    GAGATTGTCATGCACCACTCTTA
Sly-miR482e    CACCGTGACTGAATAAAATAATGTAACCCC    TGAATCAGATTCTAACCTAATCGAAC
35S     G ACGCACAATCCCACTATCC   
M13    TGTAAAACGACGGCCAGT   
1.2  方法
1.2.1 目的基因材料准备
    通过PCR,以前期研究中提取的番茄基因为模板,分别获得sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d、sly-miR482e的大量片段。通过验证后,使用试剂盒进行胶回收,将回收的基因片段与pENTR/D-TOPO过渡载体相连,通过化学转化的方法,将含目的基因的过渡载体转入大肠杆菌E.coli top10中。通过菌落PCR的方法验证得到阳性子,富集大肠杆菌阳性子,并提取质粒。将提取的质粒做酶切,获得含有目的基因的片段,并将其连接上最终载体pEG100质粒。将含有目的基因的最终载体通过化学转化的方法,转入大肠杆菌中,并验证得到阳性子。富集阳性大肠杆菌,提取其质粒,通过电转化的方法,将其转入农杆菌EHA105中,并验证得到阳性子。
上一篇:中国槌角蝗科剑角蝗科昆虫的泛生物地理学分析
下一篇:渭河南部流域底栖动物性状和功能多样性对不同空间尺度环境变量的响应关系

NO参与调控镉胁迫下番茄根系生长

番茄DNA甲基转移酶SlMET1基...

甘露醇胁迫对番茄辣椒和茄子种子萌发的影响

番茄逆境响应基因SlERF16的...

番茄逆境响应基因SlNAC10的...

番茄逆境响应基因SlERF26的...

基因改性番茄后代分析

中国学术生态细节考察《...

国内外图像分割技术研究现状

承德市事业单位档案管理...

AT89C52单片机的超声波测距...

神经外科重症监护病房患...

10万元能开儿童乐园吗,我...

医院财务风险因素分析及管理措施【2367字】

公寓空调设计任务书

C#学校科研管理系统的设计

志愿者活动的调查问卷表