番茄miR482编码基因克隆及过表达转基因植株构建筛选(3)
1.2.2转基因植株构建
将番茄野生型模式植株Micro Tom种子经75%乙醇消毒1 min，2% 次氯酸钠溶液处理15 min，无菌蒸馏水洗涤6-10次后，以适当间距播种在MS培养基上，24-26℃暗培养3-4天后，转移到16h光照/8h黑暗下培养至子叶完全展开。番茄苗期2天时，平板划线法活化携带最终表达载体的农杆菌EHA105于LB平板上，28℃培养箱中倒置培养24h，将农杆菌接种于至少3支装有5ml LB液体培养基的试管中28℃摇菌近24h（LB固体、液体培养基均含有100 mg/L 卡那霉素、30 mg/L 利福平及载体携带对应抗性）。同一天取完全伸展的番茄子叶，切除其前后两段，留取中间约0.5cm叶片，近轴面朝上置于预培养基上，24℃-26℃正面置暗培养2天。5000 rpm/min 收集农杆菌并用MS培养液重悬农杆菌，OD600值调至0.4-0.6，置于5mL离心管中。取暗培养的番茄子叶组织块泡在菌悬液中25-30min后，用无菌滤纸吸干菌液，近轴面朝上置于共培养基上，24℃-26℃暗培养2天。无菌蒸馏水漂洗外植体6-10次，每次30min，后用终浓度为250mg/l的羧苄青霉素溶液漂洗30min。用无菌滤纸吸干菌液，近轴面朝上置于后培养基上，24℃-26℃，16h光照/8h黑暗培养3天。将外植体近轴面朝上转移到分化培养基上，每两周继代一次，至抗性芽分化。当抗性芽长到1cm时，切下抗性芽并将茎基部插入生根培养基中，当有大量根长出，洗净根部培养基并移栽到土壤中，24℃-26℃，16h光照/8h黑暗培养。
1.2.3转基因植株筛选
移栽到土壤中的番茄植株，待长至适当大小时，取新生的叶片0.1g,通过试剂盒提取番茄叶片DNA，并通过PCR验证是否过表达成功。