海滨雀稗PvHMA3基因克隆及其序列分析(2)
禾本科雀稗属的海滨雀稗（Paspalum vaginatum）属多年生盐生草本植物，其原产地为热带、亚热带的海滨地带，南北纬30°以内的沿海地区是其主要的分布区域，作为优异的多年生暖季型草坪草，在园林绿化、运动场建造及盐渍地改良中有着广泛的应用价值。现有研究已经表明，海滨雀稗是暖季型草坪草中耐镉性最强的草种[3]，其土壤耐镉阈值显著高于假俭草、结缕草和杂交狗牙根[4]。因此，海滨雀稗是进行草坪草耐镉机理研究材料的理想之选。然而，目前关于草坪草的耐镉胁迫研究仅涉及耐镉评价和生理层面，其耐镉分子机制报道甚少。
土壤镉元素通过植物根系细胞质膜上的离子转运体（ZIP、NRAMP等）进入到细胞内，为了缓解镉毒害，细胞内建立了一套防御体系，主要包括镉螯合解毒、镉的区隔化及活性氧清除等作用机制。植物络合素（Phytochelatin，PC）和金属硫蛋白（MTs）是目前参与重金属镉螯合的多肽报道最多的，拟南芥植物络合素合成酶PCS基因突变导致PC含量下降，耐镉性降低；转MT基因能显著提高植物耐镉性[5]。活性氧清除机制也在耐镉途径中发挥重要作用，研究发现，过量表达水稻谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因显著提高了耐镉性[6]。镉的区隔化有多种途径，研究发现拟南芥中质膜定位的ABC-型转运体AtPDR8参与了镉的外排，有效降低了细胞内镉含量[7]。
HMA(Heavy-Metal-Transporting P-Type ATPase)是P-Type ATPase家族中的1个亚家族，该亚家族具有相对保守的结构域，包括8个跨膜结构域、1个参与转运的CPx结构域以及1个C端金属离子结合结构域，拟南芥基因组中编码8个HMA转运蛋白，分为2组，即:包括HMA1—HMA4在内的Zn/Cd/Pb/Co二价阳离子转运蛋白和包括HMA5—HMA8在内的Cu/Ag单价阳离子转运蛋白。已有研究发现，水稻液泡膜定位OsHMA3转运体将镉元素运输至根系液泡中，降低了镉向地上部运输，提高耐镉性[8]。
本研究组前期在海滨雀稗转录组库中获得了水稻OsHMA3同源基因命名PvHMA3，并通过生物信息学软件对其进行了聚类分析、跨膜区结构分析及蛋白修饰位点预测分析。该研究结果将为后期进一步揭示PvHMA3的耐镉调控机制提供参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料
多年生盐生草本植物海滨雀稗（Paspalum vaginatum）属禾本科雀稗属，其原产地为热带、亚热带的海滨地带，分布于南、北纬30°以内的沿海地区，是优异的多年生暖季型草坪草，起源于非洲和美洲，现如今其分布十分广泛，遍布热带和亚热带地区的整个区域，南非和澳大利亚的海滨区域，其野生型从美国的德克萨斯州到佛罗里达州的沿海都有分布，因为其对各种恶劣环境的较强的适应能力而闻名。海滨雀稗一开始被用作饲料，后来在园林绿化、运动场建造及盐渍地改良中广泛应用。现有研究表明，暖季型草坪草中耐镉性最强的草种就是海滨雀稗，其土壤耐镉阈值均显著高于假俭草、结缕草以及杂交狗牙根等草种。因此，以海滨雀稗为植物材料进行草坪草耐镉机理研究成为许多科研工作者的理想之选。然而，现阶段有关于草坪草耐镉胁迫的研究仅仅涉及其耐镉评价和生理层面，关于其耐镉分子机制的相关报道却非常少。
本实验所需的植物材料为海滨雀稗，培养于南京农业大学草业学院草坪团队的人工气候室。
1.1.2载体
赛默飞世尔科技公司的产品PJet1.2/Blunt载体为本实验中所使用的载体。
1.1.3试剂及试剂盒
Omega Bio-Tek公司生产的植物RNA提取试剂盒、DNA切胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒为本实验中所使用得产品。Q5高保真酶为NEB的产品。T4连接酶和第一链cDNA反转录试剂盒为TAKARA公司产品。氨苄青霉素（Amp）为北京索莱宝科技有限公司产品。南京思普金生物科技有限公司为本实验提供了引物合成和基因测序工作的相关协助。